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Jul 10, 2023

Revolucionando la fabricación biofarmacéutica con PCR Droplet Digital™ totalmente automatizada

Desde el desarrollo hasta el control de calidad y la evaluación terapéutica continua, absoluta

Desde el desarrollo hasta el control de calidad y la evaluación terapéutica continua, la cuantificación absoluta de los ácidos nucleicos puede ser la clave para llevar su producto biofarmacéutico al siguiente nivel.

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Las terapias celulares y génicas están emergiendo rápidamente como enfoques prometedores para tratar una amplia gama de enfermedades, incluido el cáncer, los trastornos genéticos y las enfermedades autoinmunes. Estas terapias a menudo implican la transferencia de material genético a las células o tejidos de un paciente, y requieren una medición precisa y exacta de los ácidos nucleicos para determinar cosas como la expresión génica, el recuento de células y los títulos virales.

Para ayudar a garantizar la seguridad y eficacia de estas terapias, los fabricantes biofarmacéuticos necesitan herramientas confiables para monitorear y analizar sus productos. La PCR digital (dPCR) se ha convertido en una tecnología poderosa para la cuantificación precisa y precisa de ácidos nucleicos en mezclas complejas, lo que la convierte en una herramienta esencial para la fabricación de terapia celular y génica. Sin embargo, dado que los desarrolladores y fabricantes de productos terapéuticos deben lograr la máxima certeza para tener confianza en sus productos y presentaciones regulatorias, deben ser perspicaces al elegir un sistema dPCR y aplicarlo a su flujo de trabajo.

En general, la tecnología de PCR digital generalmente supera a otros enfoques de cuantificación de ácidos nucleicos como la PCR cuantitativa (qPCR). Sin embargo, lograr la mayor precisión y exactitud requiere que los expertos diferencien entre los diferentes métodos y plataformas de dPCR, cada uno con sus fortalezas y limitaciones.

Droplet Digital™ PCR (ddPCR™) se ha vuelto cada vez más popular debido a su capacidad para superar algunas de las limitaciones de otros métodos de dPCR. A diferencia de otros métodos de dPCR, que generalmente usan chips, placas o micromatrices para dividir la muestra en cámaras de reacción individuales, los ensayos de ddPCR usan una técnica de emulsión de agua y aceite para dividir la muestra en miles de gotas. Esta metodología reduce el riesgo de contaminación cruzada y produce resultados más precisos y exactos, con una mayor relación señal-ruido y menos sesgo de amplificación.

Otra ventaja de la tecnología ddPCR es que es más tolerante a los inhibidores, que pueden interferir con la reacción de PCR y dar lugar a resultados falsos negativos. Los ensayos de ddPCR también son menos sensibles a las variaciones en las condiciones de reacción, como la cantidad de ADN o ARN de entrada, lo que puede afectar la exactitud y precisión de otros métodos de dPCR. Cuando estos problemas producen datos de baja calidad, los científicos biofarmacéuticos deben repetir el experimento (perdiendo así tiempo y reactivos) o buscar un usuario avanzado para establecer manualmente los umbrales e interpretar los resultados, lo que presenta un mayor potencial de error humano. Minimizar estos problemas con la tecnología ddPCR ayuda a los expertos a confiar en sus resultados, lo cual es especialmente crítico para los productos biofarmacéuticos avanzados.

Los datos de PCR digitales precisos y precisos son cruciales en el desarrollo y la fabricación de terapias celulares y génicas debido a los grandes riesgos involucrados. Estas terapias pueden potencialmente proporcionar tratamientos que cambien la vida de los pacientes, pero cualquier error en la fabricación o la dosificación podría tener graves consecuencias. Los datos inexactos o imprecisos pueden conducir a una dosificación subóptima o dañar potencialmente a los pacientes. Además, la naturaleza compleja de estas terapias, que involucran múltiples tipos de células y modificaciones genéticas, requiere una cuantificación precisa de los ácidos nucleicos diana. La tecnología ddPCR proporciona una poderosa herramienta para detectar y cuantificar estos objetivos en cada paso del proceso de producción biofarmacéutica.

Determinación del título viral

Los virus adenoasociados (AAV) son uno de los vectores virales más utilizados en terapia génica. La cuantificación precisa del título viral es esencial para optimizar la dosificación de las terapias basadas en AAV. Desafortunadamente, los ensayos tradicionales para la determinación del título de AAV pueden requerir mucho tiempo, mucho trabajo o sensibilidad inadecuada, y los resultados se ven afectados por varias variables. Por el contrario, la tecnología ddPCR puede ofrecer una cuantificación más precisa y exacta de los genomas de AAV por ml, lo que la convierte en una herramienta poderosa para la determinación del título de AAV.

Cuantificación de potencia

El número de copias transgénicas funcionales o partículas virales presentes en una muestra determina la potencia de los productos de terapia celular y génica. La potencia de estos productos es crítica, ya que afecta la eficacia de la terapia y su seguridad general. Si bien se han utilizado métodos tradicionales basados ​​en qPCR para la cuantificación de la potencia, no siempre son precisos y confiables. Por el contrario, la tecnología ddPCR puede proporcionar una cuantificación absoluta del número de secuencias diana presentes, lo que da como resultado determinaciones de potencia más precisas y fiables.

Detección de contaminantes

Los contaminantes son muy comunes y pueden ingresar a un lote terapéutico en cualquier punto del flujo de trabajo; sin embargo, sin importar por dónde entren, pueden comprometer seriamente la seguridad y eficacia del producto final. En particular, la bacteria micoplasma es un contaminante común en el cultivo celular que puede evadir la detección a través de métodos microscópicos tradicionales debido a su pequeño tamaño. Además, las técnicas estándar de detección basadas en cultivos son laboriosas, carecen de sensibilidad y pueden tardar hasta cuatro semanas en producir resultados. Por el contrario, la tecnología ddPCR ofrece un medio fiable de detección en el mismo día mediante el uso de sondas específicas que pueden detectar las firmas genéticas únicas de 112 especies de micoplasma.

Otro contaminante importante para monitorear en la fabricación de terapias celulares y génicas es el ADN de la célula huésped, particularmente en sistemas que usan la línea celular HEK293 comúnmente empleada. Si bien las células HEK293 se usan ampliamente por su capacidad para producir altos niveles de proteínas recombinantes o vectores virales, también conllevan un riesgo de contaminación del ADN en los productos posteriores. Aquí es donde la tecnología ddPCR puede proporcionar una ventaja sobre otras técnicas de PCR, ya que puede analizar con precisión los niveles de ADN de la célula huésped para garantizar que el tamaño y la cantidad del fragmento se encuentren dentro de los límites aceptables. Al proporcionar una medición más específica y precisa del ADN de la célula huésped, la ddPCR puede ayudar a minimizar el riesgo de respuestas inmunitarias u otros eventos adversos en los pacientes que reciben el producto de terapia génica final.

Cuantificación del número de copias

Los productos de terapia celular, como los linfocitos T con receptor de antígeno quimérico (CAR), se han mostrado muy prometedores en el tratamiento del cáncer. Sin embargo, la eficacia de estas terapias puede verse afectada por el número de copias transgénicas presentes en las células. Sin transgenes, una célula no contribuirá a un tratamiento eficaz, pero las células con demasiados transgenes pueden comportarse de manera anormal una vez que se inyectan en un paciente. Los métodos tradicionales basados ​​en qPCR para determinar el número de copias a menudo no son lo suficientemente precisos para la fabricación de terapia celular. Sin embargo, los ensayos de ddPCR pueden confirmar que las células terapéuticas contienen números de transgenes que se encuentran dentro del rango recomendado por los reguladores.

El sistema QX ONE™ Droplet Digital PCR (ddPCR) de Bio-Rad es un sistema ddPCR completamente automatizado diseñado específicamente para satisfacer las necesidades de los clientes biofarmacéuticos. El sistema QX ONE ha sido validado para su uso en la determinación del título de AAV, la cuantificación de la potencia, la detección de contaminantes de ADN de células huésped y micoplasma, y ​​la determinación del número de copias de terapia celular, entre otras aplicaciones.

El sistema es fácil de usar y está completamente automatizado para la operación independiente, lo que reduce el riesgo de error humano y variabilidad. Además, el software intuitivo y el flujo de trabajo simple lo hacen accesible a una amplia gama de usuarios, desde biólogos moleculares experimentados hasta aquellos con poca o ninguna experiencia en PCR.

El sistema QX ONE ddPCR permite una multiplexación avanzada que puede analizar hasta 480 muestras en un solo día, lo que permite un análisis eficiente y rentable. También ofrece software de edición reglamentaria, que incluye herramientas para ayudar a cumplir con los requisitos reglamentarios de integridad y trazabilidad de datos, lo que lo hace adecuado para su uso en un entorno GMP. Juntas, las características del sistema QX ONE ddPCR lo convierten en un instrumento ideal para la fabricación de terapia celular y génica.

Explore el sistema QX ONE ddPCR y sus numerosas aplicaciones en bio-rad.com/QXONE

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