May 18, 2023
Cerebro
Informes científicos volumen 13,
Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7740 (2023) Citar este artículo
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Este estudio trata sobre la cuantificación y validación de los niveles de BDNF en suero y plasma de ratón mediante un inmunoensayo sensible. Si bien los niveles de BDNF son fácilmente detectables en el suero humano, las implicaciones funcionales de estas mediciones no están claras, ya que el BDNF liberado de las plaquetas sanguíneas humanas es el principal contribuyente a los niveles séricos de BDNF. Como las plaquetas de ratón no contienen BDNF, este factor de confusión está ausente en el ratón. En consecuencia, se encontró que los niveles de BDNF en suero y plasma de ratón eran indistinguibles a 9,92 ± 1,97 pg/mL para suero y 10,58 ± 2,43 pg/mL para plasma (p = 0,473). Estos niveles son aproximadamente mil veces más bajos que los medidos en suero humano y la preadsorción con anti-BDNF, pero no con anticuerpos monoclonales anti-NGF o anti-NT3, redujo notablemente la señal de BDNF. Estos resultados abren la posibilidad de explorar la relevancia de los niveles de BDNF como biomarcador en los fluidos corporales accesibles utilizando modelos de ratones existentes que imitan las condiciones patológicas humanas.
El diagnóstico de enfermedades neurodegenerativas y el seguimiento de intervenciones terapéuticas se beneficiarían enormemente del desarrollo y validación de biomarcadores relevantes. Dadas las múltiples funciones del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), sería deseable contar con métodos confiables y eficientes para medir los niveles de BDNF en modelos animales adecuados y fluidos corporales relevantes. Si bien existen varios ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) de BDNF, solo permiten mediciones en tejidos donde los niveles de BDNF son comparativamente altos, como en extractos de cerebro o suero humano. Por el contrario, la sensibilidad de estos ELISA no es suficiente para medir los niveles de BDNF en suero de ratón1,2,3,4. Como el ratón es el modelo animal más utilizado para probar la relevancia de los biomarcadores y las posibles correlaciones con condiciones que reflejan enfermedades humanas, nos propusimos medir los niveles de BDNF en muestras de sangre de ratón utilizando un ELISA comercialmente disponible y altamente sensible. En ratones, a diferencia de los humanos, el gen Bdnf no se expresa a niveles significativos en los megacariocitos3, la fuente de BDNF almacenado en las plaquetas humanas y liberado tras la activación y desgranulación de las plaquetas durante el proceso de coagulación de la sangre. No obstante, resultados recientes indican que el BDNF está presente en la sangre del ratón y se origina en fuentes distintas de las plaquetas, incluida la musculatura esquelética4. Además, en el mismo estudio se demostró que el BDNF en sangre de ratón tiene relevancia fisiológica y es capaz de activar el receptor truncado de BDNF TrkB, denominado TrkBT.T1, expresado por las células β pancreáticas4. Como el receptor TrkB.T1 se expresa ampliamente fuera del sistema nervioso, parece probable que el BDNF derivado de la sangre se dirija a tejidos más allá del páncreas endocrino. La medida en que las variaciones en los niveles de BDNF en la sangre del ratón se correlacionan con las condiciones que afectan la función del sistema nervioso sigue sin estar clara, ya que aún no ha sido posible cuantificar los niveles de BDNF en la sangre del ratón.
Presentamos la caracterización y validación de un ELISA de BDNF que permite medir los niveles de BDNF en sangre de ratón. Estos niveles fueron tres órdenes de magnitud más bajos que los encontrados en primates5 y en línea con la falta de expresión génica Bdnf detectable en megacariocitos de ratón; no se encontraron diferencias en los niveles de BDNF entre el suero y el plasma de ratón.
Se recogieron muestras de sangre de ratones machos y hembras adultos y se determinaron los niveles de BDNF de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la sección "Métodos"). Se encontró que las concentraciones medias de BDNF en suero estaban en el rango bajo de pg/ml y no eran significativamente diferentes entre hombres y mujeres, con p = 0.126, prueba t no pareada (ver Fig. 1a,b). Si bien los niveles séricos informados de BDNF en humanos varían considerablemente (consulte, por ejemplo, Polacchini et al. 20156 y Naegelin et al. 20187 y sus referencias), son aproximadamente mil veces más altos en humanos, lo que refleja la liberación de plaquetas durante la coagulación sanguínea. . La falta de una expresión significativa del gen Bdnf en megacariocitos de ratón y la falta asociada de BDNF en experimentos de transferencia Western con lisados de plaquetas de ratón3, nos llevó a medir los niveles de BDNF en plasma, tanto en animales machos como hembras usando el mismo ELISA de BDNF que para suero (Fig. 2a,b). Se recogieron muestras de suero de 12 ratones adicionales (6 machos, 6 hembras, todos de 8 semanas de edad) y muestras de plasma de otros 12 ratones (6 machos, 6 hembras, todos de 8 semanas de edad). Las concentraciones medias de BDNF no difirieron significativamente: 9,92 ± 1,97 pg/ml para suero y 10,58 ± 2,43 pg/ml para plasma (p = 0,473, prueba t no pareada). No se encontraron diferencias entre hombres y mujeres en suero o plasma: suero masculino 10,31 ± 1,64 pg/mL, suero femenino 9,53 ± 2,34 pg/mL (p = 0,512), plasma masculino 10,58 ± 3,01, plasma femenino 10,57 ± 1,98 pg/ mL (p = 0,999, prueba t no pareada). Los datos confirman que en los ratones, las plaquetas no son la fuente del BDNF que se encuentra en la sangre, a diferencia de los humanos, donde contienen un reservorio importante (ver arriba), lo que resulta en concentraciones séricas de BDNF en humanos aproximadamente diez veces más altas que en el plasma7,8.
Resultados de ELISA de BDNF de muestras de suero de ratón utilizando el kit Wako ELISA de BDNF maduro, de alta sensibilidad (Fujifilm, Wako n.° 298–83,901). (a) Concentración de BDNF en pg/mL de muestras de suero de ratones C57BL6/J. Los puntos muestran las concentraciones para cada triplicado, la columna muestra la media de los tres triplicados para las muestras de cada individuo, las barras de error muestran la desviación estándar de los tres triplicados. (b) Concentración media de BDNF en suero de ratones C57BL6/J machos y hembras, p = 0,128, prueba t no apareada. Los puntos indican la concentración para animales individuales (media de triplicados), la columna indica la media del grupo, las barras de error muestran la desviación estándar.
Resultados de ELISA de BDNF de muestras de suero y plasma de ratón. (a) Concentración de BDNF en pg/mL de muestras de suero y plasma de ratones C57BL6/J. Los puntos muestran las concentraciones para cada triplicado, la columna muestra la media de los tres triplicados para las muestras de cada individuo, las barras de error muestran la desviación estándar de los tres triplicados. (b) Concentración media de las muestras de suero y plasma. Los puntos indican la concentración para animales individuales (media de triplicados), la columna indica la media del grupo, las barras de error muestran la desviación estándar, p = 0,473, prueba t no pareada.
Si bien los valores de ELISA de BDNF en suero y plasma de ratón están significativamente por encima del fondo, son realmente muy bajos y una explicación probable de fallas anteriores para detectar BDNF en muestras de suero de ratón. Sin embargo, la baja intensidad de la señal ELISA de luminiscencia plantea la cuestión de si esta señal realmente refleja la presencia de BDNF en suero o plasma de ratón. En un intento por aclarar este punto crítico, un anticuerpo monoclonal BDNF, denominado AB#9 y ampliamente caracterizado en estudios previos9,10, se unió en fase sólida a la Proteína G acoplada a perlas y se usó para probar si este anticuerpo disminuiría la señal BDNF. después de una incubación de 3 h de muestras de suero de ratón. Los resultados indican que ese fue el caso, sin que se observara una reducción en la señal en las muestras de suero de control incubadas con perlas de Proteína G solas (Fig. 3a,b). Dado que BDNF es un miembro de la pequeña familia de neurotrofinas que incluye el factor de crecimiento nervioso (NGF) y la neurotrofina-3 (NT3), también verificamos que la reducción en la señal de BDNF fuera específica de la unión de BDNF. Las perlas de proteína G recubiertas con anticuerpos monoclonales anti-NGF11 o anti-NT312 se incubaron luego con muestras de suero de ratón y se midieron los niveles de BDNF en los sobrenadantes. En contraste con los resultados obtenidos con el anticuerpo monoclonal BDNF AB#9, no se observaron diferencias significativas cuando el sobrenadante de suero se analizó antes y después de la adsorción con anticuerpos anti-NGF o anti-NT3 (Fig. 3a,b). En conjunto, estos resultados sugieren que la señal detectada por el ELISA de BDNF utilizado en el presente estudio refleja específicamente la presencia de BDNF en suero de ratón y no de NGF o NT3, aunque estas 3 proteínas forman homodímeros estrechamente relacionados, como lo demuestra su unión similar. afinidades por el receptor de neurotrofinas p7513.
Resultados de ELISA de BDNF de una muestra de suero agrupada después de la incubación con anticuerpos contra diferentes neurotrofinas. (a) Concentración de BDNF de una muestra de suero agrupada después de la incubación con perlas de proteína G solas (control), perlas de proteína G recubiertas con anti-NT3, perlas de proteína G recubiertas con anti-NGF y perlas de proteína G recubiertas con anti-BDNF. Los puntos muestran las concentraciones para cada triplicado, la columna muestra la media de los tres triplicados para las muestras de cada individuo, las barras de error muestran la desviación estándar de los tres triplicados. (b) Concentración sérica media de BDNF después de la incubación con perlas de proteína G solas (control), perlas de proteína G recubiertas con anti-NT3, perlas de proteína G recubiertas con anti-NGF y perlas de proteína G recubiertas con anti-BDNF. Los puntos indican la concentración de la muestra individual (media de los triplicados), la columna indica la media del grupo, las barras de error muestran la desviación estándar, p = 0,0001 ANOVA de una vía.
El principal resultado de este estudio es que los niveles de BDNF se pueden cuantificar fácilmente en sangre de ratón con un ELISA disponible en el mercado validado con anticuerpos específicos de BDNF. Como era de esperar, dados los fracasos anteriores para cuantificar los niveles de BDNF en suero de ratón mediante ELISA1,3, estos niveles son notablemente bajos en comparación con los niveles de BDNF determinados en suero humano (ver Introducción). Esta diferencia entre especies puede explicarse fácilmente por la falta de niveles detectables de BDNF en plaquetas de ratón, a diferencia del caso de las plaquetas humanas3. La similitud entre las concentraciones de BDNF en suero y plasma demuestra además que el BDNF detectado en suero de ratón no se deriva de plaquetas en contraste con las muestras humanas. De hecho, la recolección de plasma de sangre fresca, a diferencia del suero, incluye la adición de EDTA en el momento de la extracción de sangre, lo que evita la activación y desgranulación de las plaquetas (ver Fig. 4 y la sección "Métodos"). La presencia, pero no la cuantificación, de BDNF en plasma de ratón se informó en un estudio reciente mediante transferencias de Western utilizando un procedimiento de enriquecimiento de BDNF que involucra reactivos TrkB unidos a fase sólida4. Este mismo estudio también determinó que una fuente importante de BDNF en sangre en el ratón, posiblemente sea la musculatura esquelética.
Los niveles de BDNF en suero y plasma de ratón no cambian después de la activación/desgranulación plaquetaria, ya que se origina en fuentes como el músculo esquelético. Las plaquetas permanecen en estado de reposo en una preparación de plasma debido a la adición de EDTA. Para los seres humanos, esto significa que la gran reserva de BDNF en las plaquetas permanece dentro de los gránulos de plaquetas (a). La preparación de suero provoca la activación y desgranulación de las plaquetas, lo que conduce a una concentración mucho mayor de BDNF detectable en el suero (b). Los ratones no expresan BDNF en megacariocitos/plaquetas y, por lo tanto, la concentración de BDNF no se vio afectada por la activación plaquetaria. La similitud entre las concentraciones plasmáticas (c) y séricas (d) sugiere que la pequeña cantidad de BDNF se deriva de una fuente no plaquetaria. Creado usando Biorender.com.
Notamos que algunas muestras de ratones mostraron una distribución más amplia de lo esperado de las mediciones por triplicado (ver Fig. 1a, muestras M4, M5, M9), lo que sugiere que las posiciones de las muestras en la placa de 96 pocillos pueden haber contribuido a esta variabilidad, con una muestra en un pozo de esquina y otras 2 adyacentes a una muestra con mucha más luminiscencia. Aunque la placa de 96 pocillos es opaca, el exceso de luminiscencia de los pocillos vecinos podría contribuir a parte de la variabilidad por triplicado observada. En la práctica, este problema podría mitigarse evitando colocar muestras que se prevé que tengan valores bajos de luminiscencia junto a muestras con valores altos de la curva estándar de BDNF.
Además de ser muy sensible, el kit ELISA de BDNF utilizado aquí también es específico para BDNF, ya que la adsorción de muestras de suero de ratón con el anticuerpo monoclonal AB#9 de BDNF reduce significativamente la señal de ELISA de BDNF (Fig. 3b). Esta disminución no se observó cuando se reemplazó AB#9 por anticuerpos monoclonales producidos contra NGF o NT3 (Fig. 3a). Con respecto a la especificidad de la diana, cabe señalar que AB#9 se elevó frente a la proteína nativa BDNF9, mientras que el monoclonal anti-BDNF utilizado como anticuerpo de captura en el kit ELISA se elevó frente a un péptido correspondiente al amino terminal del BDNF maduro. Por lo tanto, es poco probable que los dos anticuerpos monoclonales BDNF utilizados en este estudio reconozcan epítopos idénticos. Además, la preparación de suero conduce a la liberación de una gran cantidad y variedad de factores de crecimiento y citocinas de las plaquetas, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y TGF-β114,15. Por lo tanto, es notable que no se observaron diferencias en las concentraciones de BDNF entre las muestras de suero y plasma de ratón, lo que demuestra aún más la especificidad del kit ELISA utilizado en el estudio.
La disponibilidad de un método sólido para la cuantificación de BDNF en suero de ratón, incluso a niveles muy bajos, abre la posibilidad de explorar ahora el papel del BDNF en los procesos metabólicos, incluido su papel en la regulación de los niveles de glucosa en sangre en modelos de ratón relevantes. Como sugieren Fulgenzi et al. (2020)4, es probable que el ejercicio físico pueda aumentar los niveles de BDNF en sangre, así como en la musculatura esquelética. Por el contrario, en los seres humanos, la interpretación de las mediciones de los niveles de BDNF en el suero se ve afectada por la contribución del BDNF plaquetario, lo que podría oscurecer las contribuciones funcionales relevantes de otros tejidos. Si bien las concentraciones plasmáticas de BDNF se han medido en humanos, los resultados son muy variables, lo que probablemente refleja el grado de activación plaquetaria durante el proceso de extracción de sangre. Los niveles de BDNF dentro de las plaquetas humanas son tales que la activación de incluso una pequeña proporción de plaquetas sería suficiente para afectar notablemente la concentración de BDNF medida en plasma. Las determinaciones del nivel de BDNF en plasma humano necesitarían mediciones adicionales de marcadores de activación de plaquetas, como el factor plaquetario 4 (PF4), que se colocaliza con BDNF en gránulos ∝ para evaluar el grado de activación.
Las características del ELISA de BDNF descrito aquí ahora permiten la cuantificación de los niveles de BDNF en fluidos corporales de ratón adecuados. Esto abre la posibilidad de que se evalúen modelos de ratón que simulan condiciones en humanos, incluida la depresión16, la enfermedad de Alzheimer17, el autismo o la esquizofrenia18, para determinar si los niveles de BDNF en suero, plasma, líquido cefalorraquídeo (LCR) o humor acuoso de ratón se correlacionan con fenotipos funcionales.
No se realizaron procedimientos en animales vivos, y el muestreo de sangre se completó post-mortem. Los estudios con ratones fueron aprobados por el Cuerpo de Revisión Ética y de Bienestar Animal de la Universidad de Cardiff, y todos los experimentos se realizaron dentro de las pautas de la Ley de Animales del Ministerio del Interior (Procedimientos Científicos) de 1986 y las regulaciones y pautas de la Institución (Universidad de Cardiff). Los métodos y resultados se informaron de acuerdo con las pautas ARRIVE. Antes de la recolección de muestras, los ratones se alojaron en jaulas M3 (48 × 15 × 13 cm, 510 cm2 de espacio en el piso) con 1 a 5 ratones adultos por jaula, a una temperatura ambiente controlada de 20 a 24 °C y una humedad del 55 %. ± 10%. Se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso a alimento ad libitum.
Se sacrificaron ratones C57BL/6 J (Charles River) usando CO2 y se recolectó sangre inmediatamente después de la muerte por punción cardíaca y se procesó para obtener plasma o suero. Se recogieron aproximadamente 800–1000 µL de sangre entera de cada ratón.
Las muestras de sangre se transfirieron a un tubo Eppendorf y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 h, seguido de 1 h a 4 °C. A continuación, las muestras se centrifugaron a 2000 G durante 10 min a 4 °C. El suero se recogió (de la parte superior del tubo) y se centrifugó de nuevo a 2000 G durante 10 min a 4 °C para eliminar las células restantes. Luego, las muestras de suero se almacenaron a -80 °C hasta que se necesitaron.
La sangre se recogió en una jeringa que contenía 20 µl de EDTA 500 mM y se mezcló bien suavemente. Luego, las muestras se centrifugaron a 2000 G durante 10 min a 4 °C. Luego, los 2/3 superiores del plasma se retiraron con cuidado y se transfirieron a un tubo nuevo antes de volver a centrifugarse a 2000 G durante 10 min a 4 °C para una mayor purificación. A continuación, se recogió este plasma, teniendo cuidado de no perturbar los residuos restantes en la base del tubo, y se dividió en alícuotas para su almacenamiento a -80 °C hasta que se necesite.
La cuantificación de la concentración de BDNF en suero y plasma se realizó con el kit Wako de ELISA para BDNF maduro, de alta sensibilidad (Fujifilm, Wako n.º 298–83,901) según las instrucciones del fabricante, utilizando los reactivos incluidos en el kit de ELISA. Brevemente, las muestras se diluyeron cuatro veces con la solución tampón del kit y se preparó el estándar de BDNF utilizando los reactivos proporcionados para generar una solución madre de 10 ng/mL. Luego, este stock se mezcló con el tampón provisto para generar una serie de soluciones estándar según las instrucciones del kit. A continuación, se descartó la solución que llenaba inicialmente la placa ELISA y se lavaron los pocillos 4 veces con la solución de lavado (1X) incluida en el kit. La placa se invirtió después de cada lavado y se secó contra toallas de papel limpias para eliminar cualquier exceso de líquido retenido en los pocillos. Se agregaron 50 µL de solución estándar diluida y de muestras diluidas a los pozos respectivos, y se usaron pozos por triplicado para cada estándar y muestra. A continuación, se cubrió la placa y se agitó en un agitador de microplacas durante 2 horas a temperatura ambiente (20–25 °C). Después de una incubación de 2 h, se descartó la solución y los pocillos se lavaron nuevamente 4 veces con solución de lavado como se indicó anteriormente. Se añadieron 50 µL de solución de anticuerpo conjugado con biotina a cada pocillo, se cubrió la placa y se incubó de nuevo en un agitador durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se descartó la solución y se lavaron los pocillos 4 veces con tampón de lavado como se indicó anteriormente. Se añadieron 50 µL de solución de estreptavidina conjugada con peroxidasa a cada pocillo, se tapó la placa y se incubó en un agitador durante 30 min a temperatura ambiente. Después de una serie final de 4 lavados con el tampón de lavado, se agregaron 50 µL de los reactivos luminiscentes mixtos 1 y 2 (1:1) a cada pocillo, se colocó la placa en un agitador durante 1 min y luego se midió la luminiscencia usando un medidor de 96-. Lector de microplacas de pocillos (FLUOstar Omega, BMG Labtech). La medición se realizó 10 min después de la adición del reactivo luminiscente. Las soluciones estándar se utilizaron para generar una curva estándar que convierte la luminiscencia en concentraciones de BDNF utilizadas para determinar la concentración de BDNF en las muestras experimentales.
Se lavaron 60 µl de perlas de Sepharose Protein G y se resuspendieron en PBS. Luego se incubaron con 30 µg de anticuerpos monoclonales anti-BDNF (Ab#9), anti-NGF, anti-NT3 (ver la sección "Resultados" para referencias) o PBS solo durante 1 h en hielo con agitación vorticial intermitente. A continuación, las perlas se centrifugaron durante 30 s a 12 000 G, después de lo cual se descartó el sobrenadante y las perlas se resuspendieron en otros 100 ml de PBS. Esto se repitió tres veces para asegurarse de que se había eliminado cualquier resto de anticuerpo no unido.
El suero de una muestra agrupada se diluyó cuatro veces con la solución tampón contenida en el kit Wako ELISA para BDNF maduro, de alta sensibilidad (Fujifilm, Wako n.° 298–83,901). Luego, cada solución que contenía perlas se resuspendió en 600 µL del suero diluido y se incubó en hielo durante 3 h con agitación vorticial intermitente. A continuación, las muestras se centrifugaron a 12 000 G durante 30 s y el sobrenadante se transfirió a un tubo Eppendorf nuevo. Este proceso se repitió tres veces para asegurar que todas las perlas de Proteína G se hubieran eliminado de la muestra de suero. A continuación, se midió la concentración de BDNF utilizando el procedimiento ELISA detallado anteriormente.
El tamaño de la muestra se seleccionó utilizando un cálculo de potencia (Gpower)19 para detectar una diferencia de 1,25 veces entre suero y plasma, asumiendo un nivel de significancia de 0,05 y con una potencia del 90% (en humanos, la concentración de BDNF en suero es aproximadamente diez veces mayor que en plasma). El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism (versión 8). La normalidad de los conjuntos de datos se probó mediante la prueba de Shapiro-Wilk (pasó la prueba de normalidad cuando alfa = 0.05). Luego se realizó la comparación de los grupos normalmente distribuidos usando una prueba t no pareada, o usando un ANOVA unidireccional para comparar múltiples grupos.
Todos los conjuntos de datos para las mediciones ELISA de luminiscencia sin procesar incluidas en este estudio se pueden encontrar en la Información complementaria.
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Descargar referencias
La financiación fue proporcionada por el programa Welsh Clinical Academic Track.
Facultad de Optometría y Ciencias de la Visión, Universidad de Cardiff, Cardiff, CF24 4HQ, Reino Unido
andrew quiere & james e. morgan
Escuela de Biociencias, Universidad de Cardiff, Cardiff, CF10 3AX, Reino Unido
Yves-Alain Barde
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AW completó la recolección de todas las muestras de plasma y suero, realizó todos los procedimientos ELISA y analizó los datos. AW y YB escribieron el manuscrito. El diseño y la supervisión del proyecto estuvieron a cargo de YB y JEM. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Correspondencia a Yves-Alain Barde.
Fujifilm WAKO Pure Chemical Corporation proporcionó los kits BDNF ELISA utilizados en este estudio y apoyo para los costos de los animales. YB es consultor de FUJIFILM WAKO Pure Chemical Corporation. El salario de AW fue proporcionado por el programa Welsh Clinical Academic Track. JEM no tiene intereses contrapuestos.
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Reimpresiones y permisos
Want, A., Morgan, JE y Barde, YA. Mediciones del factor neurotrófico derivado del cerebro en suero y plasma de ratón mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas sensible y específico. Informe científico 13, 7740 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34262-0
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Recibido: 15 de marzo de 2023
Aceptado: 26 abril 2023
Publicado: 12 mayo 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34262-0
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