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Jun 11, 2023

autofagia

Volumen de medicina BMC

BMC Medicine volumen 21, Número de artículo: 186 (2023) Citar este artículo

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El papel de la autofagia y los genes relacionados con la autofagia en la enfermedad arterial periférica (EAP) sigue siendo desconocido y puede tener valor diagnóstico y pronóstico. El objetivo de este estudio es investigar la relación entre la autofagia y la EAP e identificar posibles biomarcadores de diagnóstico o pronóstico para la práctica médica.

Los genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente en PAD se exploraron a partir de GSE57691 y se validaron en los participantes de nuestro registro WalkByLab mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). El nivel de autofagia en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de los participantes de WalkByLab se evaluó mediante el análisis de proteínas marcadoras autofágicas (beclin-1, P62, LC3B). Se utilizó el análisis de enriquecimiento de conjunto de genes de muestra única (ssGSEA) para evaluar el microambiente inmunitario dentro de la pared arterial de pacientes con EAP y personas sanas. Se utilizó una matriz de anticuerpos contra quimiocinas y un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para evaluar las quimiocinas en el plasma de los participantes. Se utilizó la prueba de cinta rodante con el protocolo de Gardner para evaluar la capacidad de caminar de los participantes. Se registraron la distancia de caminata sin dolor, la distancia máxima de caminata y el tiempo de caminata. Finalmente, se construyó un modelo de nomograma basado en regresión logística para predecir el deterioro del rendimiento de la marcha.

Se identificaron un total de 20 genes relevantes relacionados con la autofagia, y se confirmó que estos genes se expresaban en niveles bajos en nuestros participantes con PAD. La transferencia de Western demostró que la expresión de las proteínas marcadoras autofágicas beclin-1 y LC3BII se redujo significativamente en las PBMC de pacientes con PAD. ssGSEA reveló que la mayoría de los genes relacionados con la autofagia estaban fuertemente correlacionados con la función inmune, con la mayor cantidad de genes asociados que mostraban interacción entre los receptores de citoquinas y citoquinas (CCR). En este contexto, el oncogén relacionado con el crecimiento de las quimiocinas (GRO) y la proteína activadora de neutrófilos 2 (NAP2) se expresan en gran medida en el plasma de los pacientes con PAD de WalkByLab y se correlacionaron significativamente de forma negativa con la distancia recorrida evaluada mediante la prueba de cinta rodante de Gardner. Finalmente, el nivel plasmático de NAP2 (AUC: 0,743) y el modelo de nomograma derivado (AUC: 0,860) tienen un fuerte potencial predictivo para identificar una capacidad de caminar deficiente.

En general, estos datos destacan el importante papel de la autofagia y los genes relacionados con la autofagia en la EAP y los vinculan con la inflamación vascular (expresión de quimiocinas). En particular, la quimioquina NAP2 surgió como un biomarcador novedoso que se puede usar para predecir la capacidad de caminar disminuida en pacientes con EAP.

Informes de revisión por pares

La aterosclerosis de las arterias que irrigan las piernas se etiqueta comúnmente como enfermedad arterial periférica (EAP) de las extremidades inferiores. La EAP es un trastorno común y la tercera causa principal de morbilidad cardiovascular aterosclerótica, después de la enfermedad arterial coronaria (EAC) y el accidente cerebrovascular [1]. Puede manifestarse como claudicación intermitente al caminar o, en la forma más grave, isquemia crítica de miembros. La isquemia de las extremidades se define como dolor isquémico crónico en reposo, úlceras o gangrena de las extremidades inferiores, que es una de las principales causas de amputación de las extremidades y un presagio de mortalidad cardiovascular en la EAP [1, 2]. La edad, el tabaquismo, la diabetes, la hipertensión, la hipercolesterolemia y un estilo de vida sedentario son los principales factores de riesgo de la EAP [3].

La autofagia es un proceso de reciclaje celular en respuesta a diversos factores estresantes (p. ej., estrés oxidativo, hipoxia e inanición). Se ha implicado en varios procesos biológicos fundamentales, incluidos el envejecimiento, la inmunidad, el desarrollo, la tumorigénesis, la enfermedad vascular, la muerte celular y la diferenciación [4, 5]. En el sistema cardiovascular, la autofagia es un regulador clave de la homeostasis, respondiendo a estímulos fisiológicos y fisiopatológicos. Aunque el reciclaje de los orgánulos celulares generalmente se considera un proceso beneficioso, los niveles insuficientes y excesivos de autofagia pueden conducir a la muerte celular prematura (apoptosis) [6]. Hasta la fecha, hay cada vez más evidencia de que la autofagia basal juega un papel esencial en la protección de las células endoteliales y las células del músculo liso de la muerte celular y el desarrollo de enfermedades vasculares, particularmente insuficiencia cardíaca y aterosclerosis [5, 7]. La investigación actual sugiere que la autofagia también es un proceso fundamental para la homeostasis cardiovascular, la salud y el envejecimiento [8]. Hasta donde sabemos, a pesar del papel protector de la autofagia en varias enfermedades, su papel en el sistema vascular es poco conocido y completamente desconocido en el contexto de la EAP [9]. Explorar y descubrir posibles genes relacionados con la autofagia y el nivel de autofagia en la EAP, así como un vínculo funcional con procesos moleculares relevantes de la fisiopatología vascular, puede proporcionar biomarcadores potenciales para evaluar y monitorear el riesgo y el pronóstico de la enfermedad.

Recientemente, Biros et al. [10, 11] cargaron un conjunto de datos ómnibus de expresión génica (GEO) GSE57691, que reveló los genes expresados ​​diferencialmente en el tejido de la pared arterial de 49 pacientes con aneurisma aórtico abdominal, 9 pacientes con isquemia crónica de las extremidades inferiores y 10 controles sanos. En el presente estudio, reevaluamos este conjunto de datos en busca de posibles implicaciones para la isquemia de las extremidades inferiores, lo que sirvió como base para un nuevo análisis extenso. Primero, exploramos los genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente en pacientes con PAD del conjunto de datos GSE57691 y validamos la expresión de genes diana en muestras de sangre periférica de nuestros participantes del registro Lauflabor (WalkByLab). Luego se realizaron análisis de interacción proteína-proteína (PPI), ontología génica (GO) y análisis de enriquecimiento de la enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) para investigar las funciones biológicas de estos genes relacionados con la autofagia. Posteriormente, se realizó un western blot para evaluar el nivel de autofagia en las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de los participantes de WalkByLab mediante el análisis de la degradación de las proteínas marcadoras autofágicas (beclin-1, P62 y LC3B). Aquí, un fenotipo 'proinflamatorio' y la activación inmune es una característica importante de la EAP [12]. Por lo tanto, a continuación realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes de muestra única (ssGSEA) para investigar el microambiente inmunológico de la pared arterial de los pacientes con PAD y vincular los procesos inflamatorios moleculares con genes relacionados con la autofagia. Finalmente, analizamos y validamos biomarcadores potenciales para predecir la capacidad de caminar deteriorada según lo evaluado por la prueba de cinta rodante de Gardner utilizada en la práctica clínica. En particular, la prueba de cinta rodante de Gardner se considera el estándar de oro para el rendimiento físico en el diagnóstico del estado de la EAP, pero requiere equipo adecuado, tiempo y un equipo capacitado profesionalmente, por lo que rara vez se usa en la práctica clínica. En resumen, el objetivo de este estudio fue (1) obtener información sobre la relación entre las moléculas efectoras de la autofagia y la EAP, (2) vincular la autofagia con los procesos inflamatorios en el desarrollo de la EAP e (3) identificar nuevos biomarcadores que puedan predecir de manera confiable la capacidad de caminar y el estado de la EAP en la práctica clínica.

Se obtuvo un total de 232 genes de The Human Autophagy Database (http://www.autophagy.lu/index.html). El conjunto de datos del perfil de expresión de ARNm de GSE57691 se descargó de GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). GSE57691 está en la plataforma GPL10558 (Illumina HumanHT-12 V4.0 expression beadchip), que incluyó un análisis de expresión génica del tejido de la pared arterial de 49 pacientes con aneurisma aórtico abdominal, 9 pacientes con isquemia crónica de miembros inferiores y 10 controles sanos.

La matriz de expresión normalizada de datos de micromatrices se descargó del conjunto de datos GSE57691. Luego, las sondas se anotaron con los archivos de anotación del conjunto de datos. La repetibilidad de los datos en GSE57691 se verificó mediante análisis de componentes principales (PCA). El paquete "limma" del software R se utilizó para identificar los genes relacionados con la autofagia expresados ​​​​diferencialmente. Los genes con un valor P ajustado < 0,05 y |log2fold change (FC)|≥ 1 se consideraron como genes expresados ​​diferencialmente. El mapa de calor y la gráfica del volcán se realizaron utilizando los paquetes "heatmap" y "ggplot2" del software R.

El análisis PPI de genes relacionados con la autofagia expresados ​​​​diferencialmente se analizó utilizando la base de datos STRING (https://string-db.org/) y el software Cytoscape (versión 3.8.2). El análisis de correlación de los genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente se identificó utilizando la correlación de Spearman en el paquete "corrplot" del software R.

Los análisis de enriquecimiento de las rutas GO y KEGG se realizaron en el software R usando el paquete "GO plot". El análisis GO consistió en componente celular (CC), proceso biológico (BP) y función molecular (MF).

El análisis de enriquecimiento de conjunto de genes de muestra única (ssGSEA) se realizó para cuantificar los niveles de función inmune. La puntuación de enriquecimiento normalizada calculada a partir de la ssGSEA se utilizó en el paquete R 'GSVA' y 'GSEABase' [13, 14]. El archivo de conjunto de genes anotado se obtuvo del estudio de Jie-Ying Liang et al. [15]. Finalmente, cuantificamos los niveles de enriquecimiento de las 16 células inmunitarias y las 13 vías relacionadas con la inmunidad en cada muestra para revelar la función inmunitaria de la PAD, y los resultados se expresaron como puntuaciones inmunitarias.

El mapa de calor de las células inmunitarias involucradas y las vías relacionadas con la inmunidad se realizó utilizando el paquete R "pheatmap". El diagrama de caja mostró el nivel de infiltración inmunitaria en el grupo PAD y el grupo de control sano se hizo usando el paquete R "ggpubr" y "reshape2". Se realizó un mapa térmico de análisis de correlación de rango de Spearman, que reveló la correlación de diferentes niveles de infiltración de células inmunitarias y vías relacionadas con el sistema inmunitario, utilizando el paquete R "corrplot". La correlación de la expresión de genes relacionados con la autofagia y la función inmune se analizó utilizando el paquete R "ggcorrplot".

Se seleccionó un total de 179 participantes de la base de datos WalkByLab-Registry. Estos son los pacientes que se presentaron en el centro WalkByLab Brandenburg/Havel (Clínica de Brandenburgo, Escuela de Medicina de Brandenburgo) Alemania entre octubre de 2020 y agosto de 2022. El WalkyByLab tiene como objetivo examinar, diagnosticar y realizar un seguimiento interdisciplinario de pacientes con enfermedades cardiovasculares (www.lauflab. Delaware). El protocolo de prueba de registro de WalkByLab fue revisado y aprobado por el comité de ética de la Asociación Médica de Cottbus (Landesärztekammer Cottbus, número de estudio del comité de ética: AS 74(bB)/2018). El ensayo de cribado se realiza de acuerdo con los principios de la declaración de Helsinki. Las características demográficas y clínicas de los participantes en este estudio se muestran en la Tabla 1. Se realizó un análisis de coincidencia de puntuación de propensión para ajustar las diferencias en las características iniciales con la covariable de edad utilizando el paquete R "MatchIt".

Las muestras de sangre de cada participante se procesaron para aislar las PBMC utilizando la solución de Ficoll como se describió anteriormente [16]. Brevemente, se recogieron muestras de sangre venosa periférica de 15 ml en tres tubos vacutainer EDTA. A continuación, las muestras de 10 ml se diluyeron 1:1 con PBS y se colocaron cuidadosamente en capas sobre el medio de gradiente de densidad Ficoll-Paque (GE Healthcare) en una proporción de 4:3 y se centrifugaron a 400 g durante 25 min. La capa intermedia que contenía PBMC se recogió y se lavó dos veces con PBS y se almacenó a -80 °C para el aislamiento del ARN. Las muestras de 5 ml se centrifugaron a 1000 g durante 10 min, el plasma se recogió a -80 °C hasta su uso.

El ARN total se extrajo de las PBMC utilizando el reactivo Trizol (Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad y la cantidad de ARN total se midieron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop-2000 (NanoDrop Technologies). Las muestras de ARN con una proporción de 260/280 entre 1,8 y 2,0 se consideraron cualificadas. 1 μg de ARN total se transcribió inversamente en ADNc utilizando el kit de transcripción inversa QuantiTect (QIAGEN). Los niveles de ARNm del gen diana se analizaron mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real utilizando el sistema de PCR en tiempo real LightCycler® 96 (Roche). La expresión relativa de Mrna se calculó mediante el método 2−ΔΔCt. Todos los cebadores se sintetizaron y compraron en Eurofins Genomics Germany GmbH (disponible en Archivo adicional 1: Tabla S1).

Las PBMC se lisaron con tampón de lisis RIPA y las concentraciones de proteínas se determinaron con el kit de ensayo de proteínas BCA de acuerdo con el protocolo del fabricante. Posteriormente, se separaron 20 µg de proteína/pocillo utilizando SDS‑PAGE al 12 % o al 15 %. Posteriormente, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa a 250 mA durante 15 a 60 min. Luego, las membranas se bloquearon con solución salina tamponada con Tris que contenía Tween 20 al 0,1 % (TBST) y leche en polvo sin grasa al 5 % durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de eso, las membranas se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C en un agitador a baja velocidad, luego se lavaron tres veces con TBST y se incubaron con el anticuerpo secundario durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces, se añadió sustrato ECL a la membrana de nitrocelulosa. La señal se detectó mediante el sistema de captura de imágenes de VWR. La densidad de bandas se cuantificó con el software ImageJ. Todos los anticuerpos (P62, beclin1, LC3B, GAPDH y HRP) se adquirieron de Abcam.

La matriz de anticuerpos de quimiocinas humanas - membrana de Abcam se utilizó para detectar 38 quimiocinas en plasma de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las membranas recubiertas de receptores de quimiocinas se incubaron con plasma diluido durante la noche a 4 °C. Después de un lavado adecuado y de la incubación de anticuerpos con los reactivos proporcionados por los fabricantes, se tomaron imágenes de las membranas en el sistema de captura de imágenes de VWR. El análisis densitométrico de las manchas de quimiocinas se realizó con el complemento MicroArray Profile para ImageJ.

Los niveles plasmáticos de GRO y NAP2 se midieron utilizando el kit ELISA GRO humano (RayBio) y el kit ELISA NAP2 humano (Abcam) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La medición de la fiebre aftosa se considera el método estándar de oro para la evaluación de la función endotelial. Aquí, utilizamos el dispositivo médico AngioDefender (Everist Health) para medir la fiebre aftosa de los participantes, que permite un valor preciso, estandarizado y automatizado mediante la técnica de oscilación y se ha demostrado que muestra menos errores de medición en comparación con la medición de las técnicas de ultrasonido clásicas.

Se utilizó una cinta rodante y el protocolo de la cinta rodante de Gardner para evaluar la capacidad de caminar de los pacientes, como se informó anteriormente [16]. Brevemente, la velocidad de la cinta rodante se mantuvo a 3,2 km/h con un aumento de la pendiente de 2 grados cada 2 min. Esta prueba se realizó bajo la supervisión de un médico. El paciente estaba asegurado con un dispositivo drop stop (barra de seguridad con arnés de pecho). Se registraron la distancia de caminata sin dolor, la distancia máxima de caminata y el tiempo de caminata.

La capacidad reducida para caminar es una de las principales características clínicas de la EAP. Aquí, construimos un nomograma para predecir la capacidad de caminar deteriorada. Se utilizó el modelo de regresión logística con el método de selección del operador de selección y contracción mínima absoluta (LASSO) para identificar los factores relevantes y, a continuación, se construyó el nomograma utilizando los paquetes R "rms". El gráfico de calibración se usó para evaluar la precisión del nomograma, y ​​la curva característica operativa del receptor (ROC) y el valor del área bajo la curva ROC (AUC) se usaron para evaluar la eficacia predictiva.

Los análisis estadísticos y gráficos se realizaron utilizando el software R (versión 4.1.0) y R Studio. Para muestras independientes se utilizó la prueba de la t de Student. Las variables continuas se compararon mediante la prueba t si la distribución de datos cumplía los criterios de normalidad; de lo contrario, se utilizó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Primero, evaluamos la calidad de los datos y realizamos un PCA. Los datos en GSE57691 exhiben una repetibilidad satisfactoria (Fig. 1A). Para detectar genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente, a continuación analizamos la expresión de 232 genes relacionados con la autofagia en GSE57691, y se identificaron 20 genes relacionados con la autofagia utilizando los criterios de valor P ajustado < 0,05 y |log2FC|≥ 1 , incluidos 1 genes regulados al alza y 19 genes regulados a la baja, que se presentaron en mapa de calor y gráfico de volcán (Fig. 1B y C).

Genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente en PAD y muestras sanas. Un análisis de componentes principales para GSE57691. B Mapa de calor de los 20 genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente en PAD y muestras sanas. C Gráfica de volcán de los 20 genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente. Los puntos rojos representan los genes significativamente regulados al alza y los puntos azules indican los genes significativamente regulados a la baja.

Para determinar las interacciones entre los genes relacionados con la autofagia expresados ​​​​diferencialmente, realizamos un análisis PPI. Las proteínas correspondientes a los genes interactúan bioquímicamente entre sí en al menos una y hasta 10 formas diferentes (Fig. 2A). Para explorar la correlación de expresión de estos genes relacionados con la autofagia, se realizó un análisis de correlación de Spearman, que produjo una interacción potencial de 20 genes relacionados con la autofagia expresados ​​​​diferencialmente en el conjunto de datos GSE57691 (Fig. 2B).

PPI, análisis de correlación de Spearman y validación de los 20 genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente. A El PPI entre 20 genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente. B Análisis de correlación de Spearman de los 20 genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente. C Participa el histograma de los niveles de expresión de ARNm de los genes relacionados con la autofagia en WalkByLab. Se eliminaron las muestras con valores de Ct de genes de referencia superiores a 25. *P < 0,05; **P < 0,01; *** p < 0,001; ns, no significativo

Los niveles de expresión de estos genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente se validaron aún más mediante análisis qRT-PCR de PBMC de nuestra cohorte de WalkByLab Brandenburg (PAD, n = 18; controles sin PAD, n = 18. Características clínicas disponibles en el archivo adicional 1 : Tabla S2). Los niveles de expresión de los genes BNIP3, EEF2, FOXO1, HSPA5, KLHL24, MAP1LC3B, PEA15, PTEN, RAB11A, RB1CC1, RPS6KB1, SAR1A, ST13 y VAMP3 fueron significativamente más bajos en pacientes con PAD en comparación con los controles sin PAD (Fig. 2C) . Los genes BAG3, CCL2, CSTB y EEF2K tendieron a expresarse menos en el grupo PAD pero no alcanzaron significación estadística. Sin embargo, los niveles de expresión de los genes CX3CL1 y HSPB8 fueron muy bajos, por lo que no los incluimos en el análisis estadístico.

Para analizar las funciones biológicas potenciales de estos genes relacionados con la autofagia expresados ​​​​diferencialmente, realizamos análisis de enriquecimiento GO y KEGG. Los resultados revelaron que los términos enriquecidos con GO más significativos están vinculados a las funciones biológicas de la siguiente manera: 1) respuesta a los niveles de nutrientes, proceso que utiliza el mecanismo autofágico, autofagia (proceso biológico); 2) vesícula de transporte, agresoma, complejo chaperona (componente celular); y 3) unión de moléculas de adhesión celular, actividad de GTPasa, unión de proteína ligasa similar a ubiquitina (función molecular) (Fig. 3A; Archivo adicional 1: Tabla S3). En el análisis de enriquecimiento de KEGG, los genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente están principalmente involucrados en el proceso de autofagia y la vía de señalización de AMPK (Fig. 3B y C; Archivo adicional 1: Tabla S4).

Enriquecimiento GO y análisis KEGG de 20 genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente. Un análisis de enriquecimiento GO. Análisis KEGG B y C

Hasta ahora, nuestro análisis reveló que los ARNm de genes relacionados con la autofagia se expresan en niveles bajos en PBMC de pacientes con PAD y sus funciones biológicas potenciales se asocian principalmente con la autofagia según el análisis GO y KEGG. Luego, evaluamos la expresión de importantes marcadores de autofagia (p62, beclin1 y LC3B) para explorar el nivel de autofagia entre PAD y salud.

En primer lugar, se examinaron los niveles de ARNm de p62, beclin1 y LC3B en GSE57691. No se detectaron diferencias significativas en los niveles de ARNm de p62 y beclin1 entre pacientes con PAD y controles sanos. Sin embargo, se encontró que el nivel de expresión génica de LC3B estaba significativamente disminuido en pacientes con PAD (Fig. 4A). A continuación, validamos una posible desregulación de la expresión del ARNm de LC3B en PBMC de pacientes de WalkByLab mediante qRT-PCR. LC3B en WalkByLab participa se expresó menos en las PBMC de pacientes con PAD (Fig. 4B). Finalmente, evaluamos los niveles de proteína de p62, beclin1 y LC3B en las PBMC de WalkByLab participantes. Resulta que hubo una disminución significativa en los niveles de proteína beclin1 y LC3B-II en pacientes con PAD en comparación con los controles sanos (Fig. 4C). Hubo una tendencia de aumento del nivel de p62, pero no fue estadísticamente significativa. En resumen, los resultados mostraron que los niveles de proteína de los marcadores de autofagia se redujeron en las PBMC de pacientes con PAD.

Niveles de autofagia en pacientes con EAP y controles sanos (HC). Niveles de ARNm de marcadores de autofagia (p62, Beclin1 y LC3B) en GSE57691. Participa el análisis B qRT-PCR de los niveles de ARNm del marcador de autofagia LC3B en WalkByLab. C Participa el análisis de transferencia Western de los niveles de proteína de los marcadores de autofagia (p62, Beclin1 y LC3B) en WalkByLab. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ns, no significativo

La EAP es una enfermedad sistémica de las arterias, que se manifiesta en la periferia (p. ej., piernas, pies) pero que suele afectar a la mayoría de las arterias del cuerpo. La EAP también es una enfermedad inflamatoria, y el grado de inflamación sistémica es incluso mayor que en la EAC debido al gran número de arterias afectadas [17]. Por lo tanto, realizamos un ssGSEA aquí para cuantificar el microambiente inmunológico de la pared arterial y comparamos el tejido de pacientes con PAD con controles sanos. ssGSEA reveló 16 tipos de células inmunitarias y 13 tipos de vías relacionadas con el sistema inmunitario en cada muestra, que se muestra en el mapa de calor (Fig. 5A). Se identificó un mayor nivel de infiltración de células inmunitarias (incluidos aDC, iDC, mastocitos, neutrófilos, células NK, pDC, células T auxiliares, células Tfh, Th1 y Th2) en PAD en comparación con los controles sanos (Fig. 5B). Además, se observaron vías más activas relacionadas con el sistema inmunitario (incluida la coestimulación de APC, la interacción citocina-receptor de citocina (CCR), el punto de control, el MHC de clase I y la actividad de coestimulación de células T) en la EAP en comparación con los controles sanos (Fig. .5C). El análisis de correlación adicional de Spearman mostró que el subconjunto identificado de subgrupos de células inmunitarias infiltrantes y las vías relacionadas con el sistema inmunitario activo estaban moderadamente correlacionados, respectivamente (Fig. 5D y E).

El panorama del microambiente inmunitario entre pacientes con PAD y controles sanos basado en ssGSEA. Mapa de calor AA de 16 células de infiltración inmune y 13 vías relacionadas con el sistema inmunológico. B Diagrama de caja de comparaciones de 16 puntajes de enriquecimiento de células de infiltración inmune. C Diagrama de caja de comparaciones de 13 puntajes de enriquecimiento de vías relacionadas con el sistema inmunitario. D Matriz de correlación de puntuaciones ssGSEA de células inmunitarias. E Matriz de correlación de puntuaciones ssGSEA de vías relacionadas con el sistema inmunitario. F Análisis de correlación entre la expresión de 20 genes relacionados con la autofagia expresados ​​diferencialmente y el microambiente inmunitario. Rojo significa correlación positiva y azul significa correlación negativa. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ns, no significativo

A continuación, analizamos si estos 20 genes relacionados con la autofagia expresados ​​​​diferencialmente estaban correlacionados con la función inmune en PAD. Descubrimos que la mayoría de los genes relacionados con la autofagia (excepto KLHL24, HSPB8, CX3CL1 y CCL2) se correlacionaron con la infiltración de células inmunitarias y las vías relacionadas con el sistema inmunitario (Fig. 5F). Entre ellos, los genes RB1CC1 y FOXO1 mostraron el mayor número informado de relaciones con el microambiente inmunitario. La mayoría de las células inmunitarias infiltrantes vinculadas a genes relacionados con la autofagia eran PBMC como iDC (genes involucrados n = 6), pDC (n = 8) y células Th2 (n = 9). Se encontró que las principales vías relacionadas con el sistema inmunológico asociadas con genes relacionados con la autofagia eran interacciones CCR (n = 10), como se demuestra en la Fig. 5F. Específicamente, se identificaron los siguientes genes como implicados en estas vías: VAMP3, ST13, RPS6KB1, RB1CC1, PEA15, MAP1LC3B, HSPA5, FOXO1, EEF2K y BNIP3.

Dado que la interacción CCR fue la vía inmunológica más activa que se vinculó con los genes relacionados con la autofagia en el análisis de ssGSEA, y combinado con los resultados de que los genes relacionados con la autofagia y el nivel de autofagia se redujeron en las PBMC de los pacientes con EAP, sospechamos que la interacción CCR podría juegan un papel importante en el desarrollo y la progresión de la EAP. Entre las interacciones CCR, las quimiocinas son más conocidas por su capacidad para estimular la migración de leucocitos. Dado que los leucocitos son fundamentales para la progresión de la EAP y para nuestro análisis de la autofagia en las PBMC, las quimiocinas desempeñan un papel particularmente central en nuestra investigación.

Por lo tanto, utilizamos la matriz de anticuerpos de quimiocinas humanas para explorar los niveles plasmáticos de quimiocinas (3 PAD y 3 controles de salud) y descubrimos que las quimiocinas del oncogén relacionado con el crecimiento (GRO) y la proteína activadora de neutrófilos 2 (NAP2) tenían la expresión de cambio de pliegue más alta entre los dos grupos (Fig. 6A y B). Los niveles de ARNm de la familia GRO (GROα, GROβ y GROγ) y NAP2 también se expresaron altamente en pacientes con PAD en GSE57691 (Fig. 6C). Por lo tanto, a continuación utilizamos kits ELISA para medir los niveles de expresión plasmática de GRO y NAP2 en la cohorte de registro WalkByLab de 179 participantes. Los niveles de GRO y NAP2 fueron significativamente más altos en el plasma de pacientes con PAD, y NAP2 (AUC: 0,752) demostró un mejor rendimiento diagnóstico para pacientes con PAD en comparación con GRO (AUC: 0,670) (Fig. 6D). También se mostraron resultados similares en la cohorte de análisis de coincidencia de puntuación de propensión después de excluir la influencia potencial de la edad (Fig. 6E).

Los niveles plasmáticos de quimiocinas en PAD y grupos de control y la relación entre los genes relacionados con la autofagia, las quimiocinas y la función endotelial. A Participan los perfiles de expresión de quimiocinas humanas en PAD y plasma de controles sanitarios en WalkByLab. Las quimiocinas se clasifican según el valor de los cambios de log2 veces entre los dos grupos. B La expresión proteica relativa de GRO y NAP2 en PAD y controles de salud. C Los niveles de expresión de ARNm de los tres subtipos de GRO y NAP2 en GSE57691. D Los niveles plasmáticos de GRO y NAP2, así como sus valores de diagnóstico para PAD en toda la cohorte de 179 participantes. E Los niveles plasmáticos de GRO y NAP2 en la cohorte PSM de 68 participantes. Análisis de correlación F-H Spearman entre genes relacionados con la autofagia y quimiocinas y fiebre aftosa. I Análisis de correlación de Spearman entre quimiocinas y fiebre aftosa. *P < 0,05; **P < 0,01; *** p < 0,001; ns, no significativo

El análisis de correlación de Spearman, que investiga la posible correlación por pares entre estos tres factores, mostró que los genes relacionados con la autofagia KLHL24, VAMP3, HSPA5 y ST13 tenían una correlación moderadamente negativa con la quimiocina GRO (|Cor|> 0,4) (Fig. 6F), y mostró una correlación negativa de leve a moderada con la quimiocina NAP2 (|Cor|> 0,3) (Fig. 6G). Catorce genes relacionados con la autofagia se correlacionaron moderadamente positivamente con la fiebre aftosa (Cor> 0.4) (Fig. 6H). Sin embargo, las quimiocinas GRO y NAP2 no se correlacionaron con la fiebre aftosa (P > 0,05) (Fig. 6I).

La prueba de cinta rodante de Gardner es una prueba de esfuerzo con ejercicio estándar de oro, que proporciona información de diagnóstico y pronóstico clínicamente importante para los pacientes con EAP sintomática [18]. Los resultados del análisis de correlación de Spearman revelaron que había correlaciones significativas entre los niveles de GRO y NAP2 y la capacidad de caminar. Específicamente, el nivel de GRO mostró una leve correlación negativa con la distancia recorrida sin dolor (coeficiente de correlación, Cor = -0,331) y la distancia recorrida máxima (Cor = -0,340). El nivel de NAP2 demostró una correlación negativa de leve a moderada con la distancia recorrida sin dolor (Cor = -0,387) y la distancia recorrida máxima (Cor = -0,403). Además, hubo una correlación positiva moderada entre los niveles de GRO y NAP2 (Cor = 0,434), y una fuerte correlación positiva entre la distancia recorrida sin dolor y la distancia recorrida máxima (Cor = 0,913). Los gráficos de la red de correlación para las correlaciones por pares entre las variables estudiadas se muestran en la Fig. 7A (todas P <0.05).

La relación entre las quimiocinas, los genes relacionados con la autofagia y la capacidad de caminar en la cinta rodante. A La red de correlación traza las correlaciones por pares entre GRO, NAP2 y la distancia recorrida en la prueba de cinta rodante de Gardner. B Participa con un tiempo de caminata de menos de 6 minutos en la prueba de cinta rodante de Gardner y tenía niveles más altos de proteína GRO y NAP2. C Los valores de predicción de GRO y NAP2 para la capacidad de caminar disminuida en la prueba de cinta rodante de Gardner. D Análisis de correlación de Spearman entre los genes relacionados con la autofagia y la distancia recorrida en la prueba de cinta rodante de Gardner. *P < 0,05; **P < 0,01; *** p < 0,001; ns, no significativo

Además, los participantes que mostraron durante la prueba de caminata un tiempo de caminata de menos de 6 minutos tenían niveles más altos de proteína GRO y NAP2 (Fig. 7B). El análisis ROC para determinar el rendimiento diagnóstico en un tiempo de marcha inferior a 6 min mostró que NAP2 (AUC: 0,743) tenía una mayor eficacia que GRO (AUC: 0,701) (Fig. 7C).

El análisis de correlación de Spearman mostró que, a excepción de los genes CCL2 y CSTB, todos los demás genes relacionados con la autofagia exhibieron una correlación positiva significativa con la distancia recorrida, con coeficientes de correlación que iban de moderados a fuertes (0,40

Revisamos el historial de ocurrencia de MACE, incluido el accidente cerebrovascular, el ataque isquémico transitorio y el infarto de miocardio, entre los participantes inscritos. Nuestros resultados mostraron que no hubo diferencia estadística en los niveles de NAP2, GRO e índice tobillo-brazo (ABI) entre los grupos con y sin antecedentes de aparición de MACE (P > 0,5) (Archivo adicional 2: Figura S1). El AUC de GRO fue 0,529 y el de NAP2 fue 0,516, que es marginalmente más alto que el de ABI (AUC: 0,508). En general, estos biomarcadores casi tenían poco poder predictivo para MACE.

El nomograma es una poderosa herramienta utilizada para predecir la incidencia de enfermedades o el pronóstico de los pacientes. Aquí, construimos un modelo de nomograma para predecir el deterioro de la capacidad para caminar. Se definió como criterio de valoración un tiempo de marcha < 6 min en la prueba de cinta rodante de Gardner. En primer lugar, se realizó una regresión LASSO para seleccionar las variables más efectivas de todas las características clínicas y se obtuvieron diez parámetros clínicos (Fig. 8A). Los valores AUC respectivos de estos parámetros se muestran en la Fig. 8B.

Construcción del modelo de nomograma. Un análisis de regresión LASSO seleccionó las variables potenciales. La curva B ROC muestra la capacidad prevista de las variables elegidas. C Nomograma integrado con NAP2 que predice el tiempo de caminata < 6 min en la prueba de cinta rodante de Gardner. El análisis de la curva DROC compara la eficacia predicha de diferentes modelos de nomogramas. E Curvas de calibración para el tiempo de caminata previsto por el nomograma < 6 min en la prueba de cinta rodante de Gardner

Dada la correlación significativa entre los niveles de GRO y NAP2 y la capacidad para caminar, seleccionamos estos dos factores como variables candidatas para el análisis de regresión logística multivariable y la construcción de nomogramas (Fig. 8C y Archivo adicional 2: Figura S2). Debido al tamaño de muestra limitado disponible para los genes relacionados con la autofagia en nuestro estudio, optamos por no incluirlos como variables candidatas para el análisis. El análisis de curvas ROC mostró que el nomograma integrado con NAP2 (AUC: 0,860) tuvo una mejor eficacia prevista que el nomograma con GRO (AUC: 0,854) (Fig. 8D). Finalmente, se utilizaron gráficos de calibración para visualizar el desempeño de los nomogramas. El gráfico de calibración confirmó el rendimiento de nuestro modelo predictivo (Fig. 8E).

La autofagia es un proceso de auto-reciclaje celular, que está involucrado tanto en la homeostasis vascular como en la remodelación arterial fisiológica y patológica. La autofagia fisiológica sirve como un mecanismo de protección para mantener la función cardiovascular normal, mientras que la autofagia desordenada contribuye al desarrollo y progresión de enfermedades [19]. Parece desempeñar un papel protector en la fase temprana de la aterosclerosis, ya que la eliminación de los genes de autofagia (Atg5) acelera la progresión de la aterosclerosis en modelos murinos [20]. En estudios clínicos, los niveles de proteína beclin1 y cadena ligera 3 (LC3) asociados a la autofagia se redujeron en PBMC de pacientes con infarto agudo de miocardio en comparación con controles sanos o pacientes con angina de pecho estable [21]. Sobre la base de estos hallazgos, se especula que los eventos cardiovasculares agudos y el aumento de la gravedad de la enfermedad podrían conducir a una reducción de la autofagia y viceversa [6, 21]. Sin embargo, el papel de la autofagia en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares no está del todo claro, en particular, hay pocos estudios relacionados con la EAP.

En este estudio, identificamos 20 genes potenciales relacionados con la autofagia en PAD a través de análisis bioinformáticos y validamos los cambios en la expresión de estos genes en muestras de sangre periférica del ensayo de registro WalkByLab. Todos los genes identificados se expresaron en niveles bajos o tenían la tendencia de disminuir en las PBMC de los pacientes con EAP, lo que indica un papel de los genes relacionados con la autofagia en la EAP. El análisis de enriquecimiento de GO y KEGG reveló además que estos genes relacionados con la autofagia podrían estar involucrados en la actividad de la autofagia y el control de la activación de la autofagia. De hecho, el análisis de transferencia Western demostró que los niveles de proteínas marcadoras autofágicas beclin1 y LC3B se redujeron significativamente en las PBMC de pacientes con PAD. Beclin1 y LC3B son biomarcadores comunes de autofagia, que se usan ampliamente para evaluar el nivel de autofagia. Nuestro estudio ahora proporcionó evidencia de que PAD está relacionado con un nivel de expresión reducido de estos genes relacionados con la autofagia y un nivel de proteína marcador de autofagia disminuido.

La inflamación es una de las principales características de PAD. La autofagia juega un papel importante en la inflamación al regular el desarrollo, la homeostasis y la supervivencia de las células inflamatorias, como los macrófagos, los neutrófilos y los linfocitos. La autofagia también influye en la transcripción, procesamiento y liberación de una variedad de citoquinas y está regulada por citoquinas [22]. La autofagia puede desencadenar una respuesta dinámica a la inflamación. La autofagia activa suprime la respuesta inflamatoria excesiva al inhibir la activación del inflamasoma, facilitando los patrones moleculares asociados al daño y la eliminación de las mitocondrias dañadas, y destruyendo los mediadores inflamatorios [23]. La autofagia suprimida resultó en una respuesta inflamatoria mejorada [24].

Por lo tanto, exploramos las características generales del microambiente inmunitario del tejido arterial de pacientes con EAP y poblaciones sanas y la asociación con genes relacionados con la autofagia. Encontramos un nivel más alto de infiltración de células inmunitarias y vías relacionadas con el sistema inmunitario más activas en PAD y que la interacción CCR fue la vía relacionada con el sistema inmunitario más activa asociada negativamente con genes relacionados con la autofagia. Esto parece implicar que la disminución de la autofagia aumentará la inflamación en la EAP. Aquí, las citocinas incluyen las quimiocinas, la familia PDGF y la familia TGF-β [25]. Entre las interacciones CCR, las quimiocinas son más conocidas por su capacidad para estimular la migración de leucocitos (p. ej., PBMC) y se sabe que las quimiocinas en particular desempeñan un papel importante en la fisiopatología de la enfermedad cardiovascular [26]. Las quimiocinas se unen a receptores acoplados a proteínas G específicos y ejercen distintas funciones, como la regulación de la activación de los leucocitos y la coordinación de su tránsito hacia los sitios de inflamación [27]. Por ejemplo, el nivel de RANTES de quimiocinas es un marcador útil de la gravedad de la EAC porque un nivel elevado de RANTES de quimiocinas en pacientes con angina estable puede predecir el alto riesgo de formación de placas en las primeras etapas de la aterosclerosis [28]. Por lo tanto, medimos los perfiles de expresión de las quimiocinas humanas en plasma de pacientes con EAP e individuos sanos para identificar un papel potencial de las quimiocinas en la fisiopatología de la EAP. El análisis ELISA de los participantes de WalkByLab mostró que la quimiocina humana GRO y NAP2 se expresaron en gran medida en PAD, lo que también se demostró mediante un análisis estricto de puntuación de propensión después del ajuste por covariable de edad. Además, nuestro análisis indicó que GRO y NAP2 pueden ser biomarcadores de diagnóstico prometedores para PAD, como lo reflejan sus respectivos valores de AUC de 0,670 y 0,752. Además, nuestro análisis mostró que los niveles de GRO y NAP2 no estaban asociados con MACE (eventos agudos), lo que indica su especificidad para una fisiopatología sistémica relacionada con PAD. Curiosamente, nuestro estudio también reveló una correlación negativa entre los niveles de GRO y NAP2 y la expresión de los genes relacionados con la autofagia KLHL24, VAMP3, HSPA5 y ST13, lo que sugiere un posible vínculo entre la desregulación de la autofagia y la inflamación mediada por quimiocinas en la EAP. Se necesita más investigación para dilucidar la relación mecánica entre la autofagia y la señalización de GRO/NAP2 en el contexto de la fisiopatología de la EAP.

A continuación examinamos otras características cruciales de la fisiopatología de la EAP. Los cofactores y parámetros clínicos importantes para la evaluación de la EAP son la función endotelial medida por FMD y la distancia recorrida medida por una prueba de cinta rodante de Gardner. Nuestro estudio demostró que los niveles plasmáticos de GRO y NAP2 no se correlacionaron con la FMD de los participantes, pero se correlacionaron negativamente con la marcha sin dolor y la distancia máxima de marcha en la prueba de cinta rodante de Gardner. Además, GRO y NAP2 pudieron predecir una capacidad de marcha deficiente (tiempo de marcha < 6 min en la prueba de cinta rodante de Gardner) con valores AUC respectivos de 0,701 y 0,743. Aunque la FMD es un parámetro clínico muy valioso, también es muy sensible a una variedad de influencias externas, como la edad biológica, la dieta o el nivel de ejercicio del paciente [29]. Por lo tanto, en la práctica clínica, la FMD no se utiliza para el diagnóstico primario de la EAP. Sin embargo, la prueba de marcha en cinta rodante de Gardner se considera el estándar de oro para determinar con precisión el estadio de la EAP según el estadio de Fontaine. Hasta donde sabemos, nunca antes se había demostrado un papel de GRO y NAP2 para PAD en el contexto de la distancia a pie y la capacidad para caminar. Estudios anteriores se han centrado principalmente en el papel de GRO y NAP2 en el desarrollo del cáncer y la metástasis de diversas neoplasias malignas [30], mientras que pocos informes se han centrado en la enfermedad cardiovascular, y aún menos en el contexto de la EAP. En el estudio de Ku et al. [31], NAP2 regulado al alza se asoció significativamente con la gravedad de la estenosis de la arteria coronaria en pacientes con diabetes. Recientemente Wang et al. mostró que el nivel elevado de NAP2 en plasma se asoció de forma independiente con la isquemia crítica de las extremidades, no con la diabetes [32]; sin embargo, no se consideró una conexión con la capacidad para caminar. Hasta ahora nunca antes se había mostrado la desregulación de GRO en el contexto de PAD. Las quimiocinas GROα, GROβ y GROγ constituyen los tres miembros de la familia GRO [33], que junto con NAP2 comparten el receptor de quimiocinas CXCR2 como un receptor de unión común [34]. Se informó que GROγ está regulado al alza en los síndromes coronarios agudos y está relacionado con la gravedad de la respuesta inflamatoria [35]. Además, un estudio reciente demostró que el gen CXCL3 (el gen codificante de la proteína GROγ) se expresó en gran medida en el accidente cerebrovascular isquémico agudo y puede reconocerse como un predictor de un mayor volumen de infarto [36]. En resumen, las quimiocinas GRO y NAP2 parecen ser biomarcadores útiles en la EAP, en particular para predecir el deterioro de la capacidad para caminar.

Finalmente, analizamos y procesamos aún más los niveles plasmáticos de GRO o NAP2 con los parámetros clínicos relevantes obtenidos mediante el análisis LASSO para construir modelos de nomograma para la predicción de una capacidad de marcha deficiente (tiempo de marcha < 6 min en la prueba de cinta rodante de Gardner). El nomograma derivado de NAP2 mostró un buen rendimiento predictivo, con un AUC de 0,860, mientras que el nomograma derivado de GRO tuvo un AUC ligeramente inferior de 0,854. Estas pruebas demostraron que la NAP2 plasmática podría usarse como un biomarcador predictivo y el modelo de nomograma derivado predijo de manera simple y precisa la capacidad de caminar disminuida en pacientes con EAP.

El estudio aquí presentado tiene ciertas limitaciones que deben ser reconocidas. En primer lugar, el tamaño de la muestra fue relativamente pequeño y, por lo tanto, es importante tener cuidado al generalizar los resultados. En segundo lugar, este estudio fue retrospectivo y, como tal, existe la posibilidad de sesgo de selección. Sin embargo, la naturaleza retrospectiva del estudio fue necesaria para allanar el camino para futuros estudios prospectivos. En tercer lugar, se descubrió una correlación entre los genes relacionados con la autofagia y las quimiocinas con la capacidad de caminar, lo que sugiere que la autofagia puede desempeñar un papel en la progresión de la EAP al regular las quimiocinas y la inflamación. Sin embargo, este mecanismo potencial requiere una mayor validación en modelos animales y, por lo tanto, se necesitan estudios futuros para arrojar más luz sobre este tema.

En conclusión, nuestro estudio arrojó luz sobre las interrelaciones de la autofagia y los genes relacionados con la autofagia en el desarrollo de PAD, que antes se desconocían. Nuestro análisis integral identificó un conjunto de 20 genes relacionados con la autofagia que se expresaron en niveles más bajos en PAD y demostraron que los niveles de autofagia de PBMC se redujeron significativamente en pacientes con PAD. Este hallazgo tiene implicaciones significativas para futuras estrategias clínicas y para profundizar la comprensión del inicio y la progresión de la enfermedad, además de proporcionar biomarcadores novedosos. Estos resultados servirán para guiar a la clínica en el desarrollo de nuevas estrategias de pronóstico para la evaluación de la EAP. Nuestro análisis bioinformático reveló además un vínculo entre la inflamación vascular y el efecto de las citocinas, en particular las quimiocinas, con genes relacionados con la autofagia. Esto también fue validado en experimentos posteriores. Descubrimos que los niveles de GRO y NAP2 estaban elevados en el plasma de pacientes con PAD, con una correlación negativa de leve a moderada entre ellos y los genes relacionados con la autofagia KLHL24, VAMP3, HSPA5 y ST13. Los efectos de GRO y NAP2 sobre la capacidad de caminar en PAD nunca antes se habían probado. Nuestro estudio revela una correlación negativa de leve a moderada entre las quimiocinas y la distancia recorrida sin dolor y la distancia recorrida máxima en la prueba de cinta rodante de Gardner. Esto sugiere que la autofagia reducida puede influir en el inicio y la progresión de la EAP (especialmente, la capacidad para caminar) al afectar las quimiocinas (inflamación). Finalmente, construimos modelos de nomogramas que pueden predecir una mala capacidad para caminar. Los resultados mostraron que NAP2 es un biomarcador prometedor para pacientes con PAD, y su nomograma derivado tenía un potencial predictivo más fuerte que el nomograma derivado de GRO. Este nomograma proporciona una herramienta valiosa para que los médicos mejoren su comprensión del riesgo y pronóstico de la enfermedad de un paciente, lo que facilita la toma de decisiones clínicas informadas. En total, nuestro estudio proporciona nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la EAP y puede tener implicaciones para el desarrollo de nuevos enfoques diagnósticos y terapéuticos para la EAP.

En este estudio se analizaron conjuntos de datos disponibles públicamente. Estos datos se pueden encontrar aquí: base de datos GEO, número de acceso: GSE57691.

Índice tobillo braquial

Área bajo la curva ROC

Proceso biológico

Arteriopatía coronaria

Componente celular

Citoquinas y receptores de citoquinas

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Cambio de pliegue

Dilatación mediada por flujo

Ómnibus de expresión génica

Ontología de genes

Oncogén relacionado con el crecimiento

Enciclopedia de Kioto de genes y genomas

Operador de selección y contracción mínima absoluta

Cadena de luz

Eventos cardiovasculares adversos mayores

función molecular

Proteína activadora de neutrófilos2

Enfermedad arterial periférica

Células mononucleares de sangre periférica

Análisis de componentes principales

Interacción proteína-proteína

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

Característica Operativa del Receptor

Análisis de enriquecimiento de conjunto de genes de muestra única

Solución salina tamponada con Tris que contiene Tween 20 al 0,1 %

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Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL. Los autores agradecen el apoyo financiero del Estado de Brandeburgo (MWFK), el Ministerio Federal de Educación e Investigación (Bundesministerium für Bildung und Forschung) y el Consejo Chino de Becas (CSC).

Ivo Buschmann y Philipp Hillmeister contribuyeron igualmente a este trabajo.

Centro de Medicina Interna 1, Departamento de Angiología, Centro Alemán de Angiología (DAZB), Facultad de Medicina de Brandeburgo (MHB) Theodor Fontane, Clínica Universitaria de Brandeburgo, Hochstrasse 29, 14770, Brandeburgo an der Havel, Alemania

Mengjun Dai, Kangbo Li, Mesud Sacirovic, Claudia Zemmrich, Ivo Buschmann y Philipp Hillmeister

Charité – Universitätsmedizin Berlin, miembro corporativo de Freie Universität Berlin y Humboldt-Universität zu Berlin, Berlín, Alemania

Mengjun Dai, Kangbo Li y Anja Bondke Persson

Instituto de Farmacología y Medicina Preventiva, Cloppenburg, Alemania

Claudia Zemmrich y Peter Bramlage

Departamento de Cardiología, Clínica Universitaria de Graz, Graz, Austria

Eva Buschmann

Departamento de Cardiología, Centro de Medicina Interna I, Facultad de Medicina de Brandeburgo Theodor Fontane, Clínica Universitaria de Brandeburgo, Brandenburg an der Havel, Alemania

Oliver Ritter

Facultad de Ciencias de la Salud, Facultad conjunta de la Universidad Tecnológica de Brandeburgo Cottbus - Senftenberg, la Facultad de Medicina de Brandeburgo Theodor Fontane y la Universidad de Potsdam, Facultad de Medicina de Brandeburgo Theodor Fontane, Potsdam, Alemania

Oliver Ritter, Ivo Buschmann y Philipp Hillmeister

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Todos los autores hicieron una contribución significativa al trabajo informado, es decir, en la concepción y el diseño del estudio (AP, IB y PH); ejecución (MD, KL, MS y CZ); adquisición de datos, análisis e interpretación (EB, OR, PB y PH); participó en la redacción (MD, KL y MS), revisión o revisión crítica del artículo (AP, IB y PH). Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Philipp Hillmeister.

Los estudios con participantes humanos fueron revisados ​​y aprobados por el comité de ética de la Asociación Médica de Cottbus (Landesärztekammer Cottbus, número de estudio del comité de ética: AS 74(bB)/2018). El ensayo de cribado se realiza de acuerdo con los principios de la declaración de Helsinki. Los pacientes/participantes dieron su consentimiento informado por escrito para participar en este estudio.

Todos los autores dieron su aprobación final a la versión a publicar; haber acordado la revista a la que se ha enviado el artículo; y aceptar ser responsable de todos los aspectos del trabajo.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Tabla S1. Secuencias de cebadores. Tabla S2. Características clínicas de pacientes con EAP y controles en el análisis qRT-PCR. Tabla S3. Análisis de enriquecimiento GO de 20 genes relacionados con la autofagia expresados ​​​​diferencialmente. Tabla S4. Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de 20 genes relacionados con la autofagia expresados ​​​​diferencialmente.

Figura S1. La correlación entre las quimiocinas GRO/NAP2 en plasma y los principales eventos cardiovasculares adversos. Figura S2. Nomograma integrado con GRO que predice el tiempo de caminata <6 min en la prueba de cinta rodante de Gardner.

Figura S1. La imagen de transferencia original de P62. Figura S2. La imagen de transferencia original de Beclin1. Figura S3. La imagen de transferencia original de LC3B. Figura S4. La imagen de transferencia original de GAPDH.

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Dai, M., Li, K., Sacirovic, M. et al. El análisis de genes relacionados con la autofagia revela biomarcadores potenciales para la predicción del deterioro de la capacidad para caminar de la enfermedad arterial periférica. BMC Med 21, 186 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02889-5

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Recibido: 02 enero 2023

Aceptado: 02 mayo 2023

Publicado: 18 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02889-5

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