Aug 21, 2023
KLF11 regula la ferroptosis y la quimiosensibilidad del adenocarcinoma de pulmón mediante la supresión de GPX4
Volumen de biología de las comunicaciones
Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 570 (2023) Citar este artículo
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Se ha demostrado que la ferroptosis, una muerte celular no apoptótica dependiente del hierro, desempeña un papel vital en la proliferación tumoral y la resistencia a la quimioterapia. Aquí, informamos que KLF11 inhibe la proliferación de células de adenocarcinoma de pulmón (LUAD) y promueve la sensibilidad a la quimioterapia al participar en la vía de ferroptosis relacionada con GPX4. A través de una pantalla de secuencia de ARN del pretratamiento de células LUAD con inductores de ferroptosis (FIN), descubrimos que la expresión de KLF11 era significativamente mayor en las células tratadas con FIN, lo que sugiere que KLF11 puede estar involucrado en la ferroptosis. La sobreexpresión de KLF11 promovió que las células LUAD sufrieran alteraciones de ferroptosis. Mientras tanto, la regulación positiva de la expresión de KLF11 también inhibió la proliferación celular y aumentó la quimiosensibilidad, mientras que la eliminación de KLF11 hizo lo contrario. Con ChIP-Seq y RNA-Seq, identificamos a GPX4 como un objetivo aguas abajo de KLF11. A través de ChIP-qPCR y el ensayo de luciferasa dual, aclaramos que KLF11 se une a la región promotora de GPX4 y reprime su transcripción. La expresión restaurada de GPX4 antagonizó la capacidad de KLF11 para promover la ferroptosis, aumentar la sensibilidad a la quimioterapia e inhibir la proliferación celular in vitro e in vivo. Clínicamente, KLF11 disminuyó en LUAD y su baja expresión se asoció con una supervivencia reducida del paciente. Nuestros hallazgos establecieron la función de KLF11 para promover la ferroptosis en LUAD, inhibiendo así la proliferación celular y mejorando la eficacia de la quimioterapia.
El adenocarcinoma de pulmón (LUAD) es el subtipo más común de cáncer de pulmón y es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo1,2. LUAD tiene una capacidad proliferativa relativamente fuerte con un pobre resultado de supervivencia, y la quimioterapia sigue siendo uno de los principales tratamientos para este tipo de tumor maligno. Sin embargo, la resistencia a la quimioterapia afecta en gran medida el pronóstico de los pacientes con LUAD3,4,5. Por lo tanto, es imperativo explorar formas de inhibir la proliferación de LUAD y aumentar la sensibilidad de la quimioterapia en LUAD.
La ferroptosis, una forma de muerte celular reguladora dependiente del hierro causada por una peroxidación lipídica excesiva, está asociada con una variedad de contextos biológicos, desde el desarrollo hasta el envejecimiento, la inmunidad y la carcinogénesis, mientras que la pérdida de ferroptosis puede impulsar la tumorigénesis y promover la proliferación tumoral6. Es importante destacar que se ha demostrado que la ferroptosis está implicada en la resistencia a la quimioterapia, y la inducción de la ferroptosis podría mejorar la sensibilidad a la quimioterapia7. La glutatión peroxidasa 4 (GPX4) es un supresor central del proceso de ferroptosis, reduciendo la peroxidación lipídica al disminuir la conversión de GSH, inhibiendo así la ferroptosis8,9. Además, los estudios han encontrado que el aumento de la expresión de GPX4 está estrechamente asociado con la tumorigénesis y la metástasis10. Sin embargo, el proceso que afecta a la ferroptosis mediante la regulación de GPX4 en el cáncer sigue sin estar claro.
El factor 11 similar a Kruppel (KLF11) es un miembro de la familia de factores de transcripción de dedos de zinc similares a Kruppel. En este estudio, encontramos que KLF11 estaba regulado al alza en las líneas celulares LUAD después del tratamiento con FIN, lo que indica que KLF11 puede estar involucrado en la regulación de la ferroptosis en LUAD. Sin embargo, no se ha informado sobre la participación de KLF11 en la ferroptosis y el mecanismo. Aquí, con la combinación de secuenciación del transcriptoma y ChIP-seq, identificamos sistemáticamente a KLF11 como un represor de la transcripción para GPX4 y revelamos que la sobreexpresión de KLF11 estimula la ferroptosis de LUAD, lo que inhibe el crecimiento celular y sensibiliza las células LUAD a la quimioterapia.
En primer lugar, inducimos ferroptosis utilizando FIN (RSL3 e IKE) en las células de cáncer de pulmón A549 y la secuenciación del ARN se realizó en células tratadas y no tratadas (Fig. 1a). Descubrimos que el nivel de ARNm de KLF11 estaba significativamente aumentado en las líneas celulares A549 tratadas con RSL3 o IKE en comparación con el grupo no tratado (Fig. 1b, c). Para corroborar los resultados de la secuenciación, se usaron qPCR y western blot para detectar la expresión de proteína y ARN de KLF11 bajo diferentes tratamientos en células LUAD. De acuerdo con los resultados de RNA-Seq, el ARNm de KLF11 aumentó después de la adición de FIN en células A549 y PC9, mientras que no se observó un cambio significativo en la expresión de KLF11 después de la adición simultánea del inhibidor de ferroptosis (Ferr-1 y DFO, el potente y selectivo inhibidor de la ferroptosis) en comparación con el grupo de control (Fig. 1d, e). A nivel de proteína, se obtuvieron resultados consistentes (Fig. 1f, g), lo que indica que la ferroptosis activa la expresión de KLF11 y KLF11 puede participar en el proceso de ferroptosis.
un diagrama esquemático del flujo de trabajo de detección de RNA-seq en la línea celular A549. b, c Diagrama de volcán que ilustra KLF11 involucrado en la regulación de la ferroptosis inducida por RSL3 e IKE. d, e El nivel de ARN de KLF11 se midió después del tratamiento con RSL3 o DFO + RSL3 o Ferr1 + RSL3 en las líneas celulares A549 y PC9. f, el nivel de proteína g KLF11 se midió después del tratamiento con RSL3 o DFO + RSL3 o Ferr1 + RSL3 en las líneas celulares A549 y PC9.
A continuación, descubrimos que KLF11 se expresó significativamente menos en las líneas celulares LUAD que en las células epiteliales bronquiales normales (Fig. 1a complementaria). Dados los resultados anteriores, utilizamos dos líneas celulares LUAD, A549 y PC9, para generar células KLF11-overexpression(OE) y KLF11-knockout (KO) con la herramienta CRISPR/Cas9. Contra el grupo de control negativo (NC), qRT-PCR y western blot mostraron que KLF11 se sobreexpresó o eliminó con éxito (Fig. 2a-d). Después del tratamiento con RSL3 o IKE, la actividad de las células A549 y PC9 en el grupo KLF11-OE disminuyó significativamente y el nivel de peroxidación de lípidos intracelulares aumentó (Fig. 2e-l). Por el contrario, la desactivación de KLF11 resultó en un aumento significativo en las actividades celulares y una disminución significativa en los niveles de peroxidación de lípidos intracelulares en comparación con el grupo KLF11-NC (Fig. 2e-l). Como es sabido, un cambio característico en las células que experimentan ferroptosis es la reducción del volumen mitocondrial, las densidades de la membrana mitocondrial condensada, la reducción o desaparición de las crestas mitocondriales y la ruptura de la membrana mitocondrial externa11. A continuación, realizamos un análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) para su estudio. Después de ser inducidas por FIN, las células KLF11-OE A549 contenían más mitocondrias encogidas con una densidad de membrana elevada y una reducción de las crestas mitocondriales en comparación con el grupo KLF11-NC y KO (Fig. 3a). Posteriormente, exploramos el efecto de KLF11 en la capacidad proliferativa de las células LUAD utilizando el ensayo CCK-8 y descubrimos que la sobreexpresión de KLF11 inhibió significativamente la capacidad de proliferación de las células A549 y PC9, mientras que la eliminación de KLF11 obtuvo el resultado opuesto (Fig. 3b, C). Además, se descubrió que KLF11 aumenta los efectos tóxicos de los agentes quimioterapéuticos (CDDP y Pem) en las células LUAD (Fig. 3d-g). Posteriormente, la ferroptosis promovida por KLF11 en células LUAD puede ser rescatada por el inhibidor de ferroptosis Ferrostatin-1 (Ferr-1), pero no por el inhibidor de apoptosis Z-VAD-FAM (Fig. 3h-k). En conjunto, los resultados sugieren que KLF11 promueve la ferroptosis inducida por FIN, inhibe la proliferación celular y mejora la responsabilidad del agente quimioterapéutico en LUAD.
a–d qRT-PCR y western blot que confirman la sobreexpresión y la desactivación de KLF11 en células A549 y PC9. Ensayo e-h CCK-8 para detectar la actividad celular de células A549 y PC9 con diferentes niveles de KLF11 después de 24 h de tratamiento con diferentes dosis de RSL3 e IKE. i–l La peroxidación lipídica se midió mediante citometría de flujo después de la tinción con C11-BODIPY en el tratamiento con KLF11-NC, KLF11-OE y KLF11-KO mediante RSL3 o IKE.
a Alteraciones características de las mitocondrias en células A549 tratadas con RSL3 o IKE analizadas por TEM, Barras de escala: 50 nm. b, c La desregulación de la expresión de KLF11 afecta la capacidad de proliferación de las células A549 y PC9. d-g Curvas de dosis-toxicidad que muestran la viabilidad de las células A549 y PC9 transfectadas con KLF11-NC, KLF11-OE y KLF11-KO tras el tratamiento con CDDP o Pem a las concentraciones indicadas durante 48 h. h–k La viabilidad de las células A549 y PC9 transfectadas con KLF11-NC, KLF11-OE y KLF11-KO se midió después de 24 h de tratamiento con RSL3/IKE, RSL3/IKE+Ferr1 o RSL3/IKE+Z-VAD.
Para explorar las moléculas de señalización aguas abajo de KLF11 que promueven la ferroptosis, realizamos RNA-seq en células KLF11-NC y KLF11-OE respectivamente (Fig. 4a) y mostramos genes expresados diferencialmente (Fig. 4b) Luego, tomamos la intersección de los resultados entre RNA-Seq, ChIP-Seq y el conjunto de genes específicos de ferroptosis (obtenido de bases de datos públicas, http://www.zhounan.org/ferrdb/current/) (Fig. 4c). Los resultados indicaron que GPX4 se reguló significativamente a la baja con la sobreexpresión de KLF11, lo que implica que GPX4 puede ser una molécula diana de KLF11. Verificamos aún más el efecto de KLF11 en la expresión de GPX4 mediante qRT-PCR y western blot y encontramos que la sobreexpresión de KLF11 disminuyó el nivel de GPX4, mientras que la eliminación de KLF11 condujo a la regulación positiva de GPX4 (Fig. 4d-g y Fig. 1b, c complementaria) . Sin embargo, el nivel de otros reguladores clave de la ferroptosis, incluidos ACSL4 y SLC7A11, no se vio afectado (Fig. 4d-g). Estos resultados sugieren que KLF11 puede estar involucrado en la ferroptosis LUAD al regular la expresión de GPX4.
un diagrama esquemático del flujo de trabajo de detección de RNA-seq en la línea celular A549 transfectada con KLF11-NC y KLF11-OE. b Gráfica de volcán que muestra la expresión diferencial de genes entre A549-KLF11-NC y KLF11-OE. c Diagrama de Venn que muestra la intersección de los objetivos predichos de KLF11. d, e Los resultados de qRT-PCR mostraron diferencias en los niveles de ARN de tres moléculas clave (GPX4, SLC7A11 y ASCL4) de ferroptosis entre las líneas celulares KLF11-NC, KLF11-OE y KLF11-KO de A549 y PC9. Los resultados de f, g Western blot mostraron diferencias en los niveles de proteína de GPX4, SLC7A11 y ASCL4 de ferroptosis entre las líneas celulares KLF11-NC, KLF11-OE y KLF11-KO de A549 y PC9.
Como factor de transcripción, especulamos que KLF11 suprime transcripcionalmente GPX4 al unirse a sus promotores. Para validar esta hipótesis, posteriormente realizamos ChIP-seq de todo el genoma y analizamos los datos de todo el genoma del proyecto ENCODE. De manera consistente, nuestros resultados revelaron un pico de unión a KLF11 muy fuerte en una región promotora de GPX4 próxima al sitio de inicio de la transcripción (TSS). Identificamos esta región máxima de aproximadamente 454 pb de longitud como el sitio de unión (BS) en GPX4 (Fig. 5a-c). El ensayo ChIP-PCR también mostró enriquecimientos significativos del atracón de KLF11 en las líneas celulares A549 y PC9 (Fig. 5d, e). Estos resultados establecen a GPX4 como un objetivo transcripcional directo de KLF11.
a, b Los datos de todo el genoma del proyecto ENCODE y nuestros resultados de ChIP-seq muestran el sólido pico de unión de KLF11 en la región promotora cerca del TSS de GPX4. c Secuencias características predichas por JASPAR para la unión transcripcional de KLF11. d, e Ensayo ChIP-qPCR que representa los enriquecimientos de la unión de KLF11 en A549 y PC9. f Diagrama esquemático que muestra los posibles sitios de unión de KLF11 a la región crítica del promotor GPX4 mutados. g Ensayos duales de actividad de luciferasa para analizar la intensidad de fluorescencia de KLF11-NC y KLF11-OE con o sin mutaciones en la región promotora de GPX4.
Para investigar si el enlace de KLF11 con el promotor GPX4 es funcional, clonamos las secuencias del promotor GPX4 humano en el vector informador PGL4-luciferasa para experimentos de actividad informadora de luciferasa. Como control negativo, se predijeron y modificaron los sitios donde KLF11 se une con alta probabilidad en el BS utilizando los motivos de consenso en JASPAR (Fig. 5f). Como resultado, la sobreexpresión de KLF11 en células 293T atenuó notablemente la actividad del indicador de luciferasa que contenía las secuencias del promotor GPX4 de tipo salvaje (WT). Y, sin embargo, el reportero con construcciones de promotor GPX4 de tipo mutante (MT) no mostró una caída de luciferasa en respuesta a la sobreexpresión de KLF11 (Fig. 5g). Los resultados anteriores revelaron el mecanismo de interacción entre KLF11 y GPX4, lo que sugiere que KLF11 se une fuertemente al promotor de GPX4 e inhibe la transcripción de GPX4.
Los resultados anteriores indican que KLF11 promueve la ferroptosis en las células tumorales al inhibir la transcripción de GPX4. Por lo tanto, luego restauramos la expresión de GPX4 en las líneas celulares KLF11-OE y NC (Fig. 6a-f). Encontramos que la alta expresión de GPX4 causó una resistencia significativa de las células LUAD a las FIN (Fig. 6g-j). Además, la alta expresión de GPX4 también resultó en una reducción significativa en los niveles de ROS intracelulares en las líneas celulares KLF-OE y NC después del tratamiento con FIN (Fig. 6k-n). Además, el ensayo TEM reveló que después del tratamiento con FIN, las células que restauraron la expresión de GPX4 exhibieron características de resistencia a la ferroptosis, caracterizadas por una morfología mitocondrial casi normal (Fig. 6o). La diferencia en la sensibilidad de FIN entre las dos líneas celulares disminuyó. Con respecto al efecto sobre la proliferación, la expresión de GPX4 mejoró significativamente la capacidad de proliferación en las líneas celulares KLF11-OE y NC LUAD (Fig. 6p-q). Curiosamente, la reversión a la expresión de GPX4 atenuó significativamente la respuesta tóxica de la quimioterapia promovida por KLF11 a las células de adenocarcinoma de pulmón (Fig. 7a-d). Estos resultados sugieren que GPX4 puede antagonizar la función de promoción de ferroptosis mediada por KLF11 e inhibición de la proliferación celular.
a–f qRT-PCR y western blot que confirman la expresión restaurada de GPX4 en células A549 y PC9 transfectadas con KLF11-NC y KLF11-OE. g–j Curvas de dosis-toxicidad que muestran la viabilidad de las células A549 y PC9 transfectadas con KLF11-NC, KLF11-OE, KLF11-NC+GPX4 y KLF11-OE+GPX4 tras el tratamiento con RSL3 o IKE a las concentraciones indicadas durante 24 h. La peroxidación lipídica k-n se midió mediante citometría de flujo después de la tinción con C11-BODIPY en el tratamiento con KLF11-NC, KLF11-OE, KLF11-NC+GPX4 y KLF11-OE+GPX4 mediante RSL3 o IKE. o Alteraciones características de las mitocondrias en células A549 tratadas con RSL3 o IKE analizadas por TEM después de restaurar la expresión de GPX4, Barras de escala: 50 nm. p, q La expresión de GPX4 promueve la proliferación de células A549 y PC9 inhibidas por KLF11.
a–d Curvas de dosis-toxicidad que muestran la viabilidad de las células A549 y PC9 transfectadas con KLF11-NC, KLF11-OE, KLF11-NC+GPX4 y KLF11-OE+GPX4 tras el tratamiento con CDDP o Pem a las concentraciones indicadas durante 48 h. e Diagrama esquemático que muestra el proceso de formación de tumores subcutáneos en ratones desnudos y las medidas de tratamiento. f Tumores representativos formados en ratones desnudos por células KLF11-NC(a), KLF11-OE(b), KLF11-NC+GPX4(c) y KLF11-OE+GPX4(d) tras el tratamiento con IKE o CDDP+Pem. g El peso del tumor final formado entre diferentes grupos. h La expresión de KLF11 entre tejidos normales adyacentes y tejidos tumorales de pacientes con LUAD en nuestro hospital. i La expresión de KLF11 se correlacionó negativamente con GPX4. j La baja expresión de KLF11 en LUAD en comparación con el tejido pulmonar normal se verificó en la base de datos TCGA. k, l Tanto nuestra cohorte como la cohorte TCGA mostraron una correlación positiva entre la expresión de KLF11 y el pronóstico en pacientes con LUAD. m Mecanismo de regulación KLF11 de la transcripción GPX4.
Para validar los resultados obtenidos anteriormente in vivo, la formación de tumores subcutáneos se realizó por vía subcutánea mediante la inyección de diferentes células A549 (KLF11-NC, KLF11-OE, KLF11-NC+GPX4, KLF11-OE+GPX4) en ratones desnudos (Fig. 7e). A lo largo del período, observamos regularmente el crecimiento del tumor mientras medimos y registramos el tamaño del tumor semanalmente. Después de 4 semanas, se sacrificó a los ratones desnudos y se extirparon los tumores, y se midieron todos los pesos de los tumores. Los resultados mostraron que la formación de tumores en ratones desnudos inyectados con células KLF11-OE se suprimió significativamente en comparación con el grupo KLF11-NC (Fig. 7fa-b-g). Además, de acuerdo con los experimentos in vitro, es interesante notar que esta inhibición es suprimida por la restauración de la expresión de GPX4 (Fig. 7fc-d-g). Además, diferentes grupos de ratones desnudos fueron tratados con FIN o agentes quimioterapéuticos durante la proliferación tumoral y se encontró que los tumores en el grupo KLF11-OE retrocedieron significativamente en comparación con los grupos KLF11-NC+GPX4 y KLF11-OE+GPX4 (Fig. 7f, g).
Para explorar la importancia clínica de KLF11 en LUAD, buscamos en la base de datos TCGA y encontramos que KLF11 se expresó de forma baja en tejidos LUAD (Fig. 7h), y su nivel de expresión se correlacionó positivamente con el pronóstico de los pacientes con LUAD (Fig. 7i). Para verificar los resultados, analizamos retrospectivamente las características clinicopatológicas y el pronóstico de 150 pacientes con LUAD con datos de seguimiento completos en 2014 (Tabla complementaria S4). La tinción IHC también mostró una expresión de KLF11 relativamente baja en tejidos LUAD, mientras que esta expresión fue notablemente alta en tejidos no tumorales (Fig. 7j). Además, el nivel de KLF11 se correlacionó negativamente con la expresión de GPX4 (Fig. 7k, Fig. 2a complementaria y Tabla complementaria S4). Además, los análisis de Kaplan-Meier mostraron que la baja expresión de KLF11 se correlaciona significativamente con una supervivencia general deficiente de los pacientes con LUAD (Fig. 7l), y un modelo de riesgos proporcionales multivariado de Cox indicó que la baja expresión de KLF11 era un predictor pronóstico independiente de SG (P = 0,043). , Tabla complementaria S5). Un total de 48 pacientes de los 150 pacientes con LUAD experimentaron quimioterapia adyuvante posoperatoria (ACT) de los 150 pacientes con LUAD. Definimos a los que recayeron antes del corte del seguimiento como quimiorresistentes y a los que no recayeron como quimiosensibles. Las características clinicopatológicas de los 48 casos se muestran en la Tabla complementaria S6. Encontramos que la expresión baja de KLF11, así como la expresión alta de GPX4, se asociaron con quimiorresistencia (Tabla complementaria S6), y la expresión de KLF11 se asoció negativamente con la expresión de GPX4 (Figura complementaria 2b).
La ferroptosis es un modo de muerte celular regulado dependiente del hierro, identificado en 2012, marcado por la cantidad excesiva de peroxidación de lípidos celulares, lo que finalmente conduce a la ruptura de la membrana plasmática y la muerte celular12,13. La creciente evidencia ha demostrado que la desregulación de la ferroptosis juega un papel vital en el desarrollo del cáncer humano14,15,16. En este estudio, revelamos que KLF11 está involucrado en la regulación de la ferroptosis. Nuestros resultados mostraron que el estrés por ferroptosis conduce a un aumento en la expresión de KLF11, lo que puede mejorar la sensibilidad celular a la ferroptosis y la quimioterapia al inhibir la transcripción de GPX4 (Fig. 7m).
Los KLFs son una familia de factores de transcripción que están implicados en diversos procesos fisiopatológicos. Anteriormente, nuestro grupo ha prestado atención a la familia KLF y ha llevado a cabo una investigación en la etapa inicial. Coincidentemente, también hemos encontrado la participación de KLF11, un miembro de la familia KLF, en la ferroptosis de LUAD mediante secuenciación de alto rendimiento. Además, las bases de datos públicas mostraron una expresión aberrante de KLF11 en múltiples tejidos tumorales y se ha demostrado que KLF11 desempeña un papel crucial durante la tumorigénesis y el desarrollo17,18,19. Por lo tanto, realizamos este estudio para explorar el papel de KLF11 en la ferroptosis y la quimioterapia de LUAD. Estructuralmente, KLF11 media la represión transcripcional ya que contiene tres dominios estructurales represivos (R1, R2 y R3) en su región reguladora transcripcional N-terminal17,20,21. El dominio estructural R1 es un motivo represor helicoidal α (HRM) que reprime la activación transcripcional de genes diana a través de la interacción con el co-represor mSin3A21. Muchos estudios también han confirmado que KLF11 es un factor de transcripción represivo18,19,22. Mecánicamente, KLF11 recluta mSin3a para reprimir la transcripción del promotor Smad7 a través de sitios ricos en GC, luego desregula el bucle de retroalimentación negativa en la vía de señalización de TGF-β y promueve la activación de la vía de señalización antiproliferativa, lo que inhibe el crecimiento de células epiteliales20,23 . Además, la expresión de KLF11 puede suprimir la expresión de SOD2 y Catalase1, que son genes clave para la eliminación del estrés oxidativo, el crecimiento celular inhibido y la apoptosis inducida in vitro e in vivo19. Por lo tanto, KLF11 puede afectar el crecimiento celular y la carcinogénesis a través de múltiples mecanismos17, y no se ha determinado si participa en la ferroptosis. En nuestro estudio, se descubrió que la expresión de KLF11 aumentaba mediante secuenciación de alto rendimiento en células LUAD después del tratamiento con FIN, y la alteración de los niveles de KLF11 afectó significativamente la sensibilidad de las células LUAD a FIN, lo que establece que KLF11 está involucrado en la regulación de la ferroptosis en LUAD . Dado que KLF11 es un factor de transcripción funcional y participa en la ferroptosis, asumimos que KLF11 puede regular la molécula clave de la vía de la ferroptosis. Como demostraron estudios previos, la ferroptosis puede ser regulada por múltiples factores críticos10,24. Como molécula clave en la vía endógena de la ferroptosis, se considera que la GPX4 es la enzima antioxidante que utiliza el glutatión reducido (GSH) como cofactor para desintoxicar la peroxidación lipídica, actuando así como el guardián para inhibir la aparición de ferroptosis8,10,25, 26,27. Las células cancerosas también pueden contrarrestar su susceptibilidad a la ferroptosis mediante la regulación de GPX4 en la vía de la ferroptosis. Se demostró que la supresión genética de GPX4 induce ferroptosis en las células tumorales e inhibe el crecimiento tumoral10. Sin embargo, el mecanismo regulador de GPX4 durante la ferroptosis de células cancerosas aún debe investigarse más a fondo. Como lo indican los ensayos de transferencia Western blot, ChIP-Seq y indicador de luciferasa dual, nuestros resultados sugieren que GPX4 es una molécula objetivo reguladora de la transcripción de KLF11, que actúa como un factor de transcripción represor al unirse a la región promotora de GPX4, inhibiendo así su transcripción. Además, la expresión de GPX4 puede antagonizar la capacidad de KLF11 para promover la ferroptosis, lo que sugiere que GPX4 es un objetivo específico de KLF11 en la vía de la ferroptosis. Además, teniendo en cuenta que los niveles de luciferasa de los promotores WT y MT GPX4 se vieron afectados por el tratamiento con FIN, hemos realizado experimentos para comparar el nivel de luciferasa de los promotores WT y MT GPX4 con FIN no tratados y tratados. Descubrimos que en el grupo GPX4 WT, los niveles de luciferasa de las células en el grupo tratado con FIN estaban ligeramente elevados en comparación con el grupo DMSO, pero no estadísticamente significativos. De manera similar, los valores de fluorescencia de las células en el grupo MT aumentaron levemente después del tratamiento con FIN, y el aumento fue más significativo que en el grupo WT, pero los resultados tampoco fueron estadísticamente significativos (Figura complementaria 1e), lo que sugiere que el mecanismo regulador de GPX4 es complejo, y puede haber otros mecanismos además de la regulación de KLF11. Teniendo en cuenta que los iones de hierro intracelulares están involucrados en otro mecanismo regulador de la ferroptosis, no hay evidencia de que la modulación de GPX4 pueda afectar los niveles de iones de hierro intracelulares. Examinamos la concentración de iones de hierro en la sobreexpresión de KLF11 y las células A549 y PC-9 knock-out y descubrimos que las diferentes expresiones de KLF11 no afectaron los niveles de iones de hierro intracelulares (Fig. 1d complementaria).
Recientemente, la terapia de ferroptosis mostró un efecto sinérgico en el tratamiento del cáncer con la quimiorradioterapia tradicional y la inmunoterapia16. En la actualidad, la quimioterapia sigue siendo el tratamiento principal para los pacientes con LUAD. Desafortunadamente, el desarrollo de resistencia a la quimioterapia tumoral es una de las razones importantes del fracaso de la terapia antitumoral. Dado que la ferroptosis puede ser inducida por quimioterapia, su regulación está estrechamente relacionada con la progresión tumoral y la resistencia a la quimioterapia7,9. Estudios recientes han indicado que GPX4 juega un papel esencial en la resistencia tumoral a la quimioterapia o radioterapia9,28. Dado que nuestro estudio ha confirmado que KLF11 promueve la ferroptosis LUAD al suprimir GPX4, y se ha demostrado que KLF11 está asociado con una respuesta inferior a la quimioterapia en sarcomas18. Especulamos que KLF11 también puede estar involucrado en la resistencia de LUAD a la quimioterapia a través de la regulación de la expresión de GPX4. De acuerdo con la suposición, nuestros resultados mostraron que la expresión de KLF11 podría inhibir la proliferación de células LUAD al tiempo que mejora la respuesta tóxica de LUAD a los fármacos quimioterapéuticos in vitro e in vivo. Más importante aún, la expresión restaurada de GPX4 pudo suprimir la quimiosensibilidad mejorada de LUAD por KLF11, lo que indica que KLF11 puede aliviar la resistencia de las células a los fármacos quimioterapéuticos al mejorar su ferroptosis. Desde el punto de vista clinicopatológico, también encontramos que KLF11 tenía una expresión baja en los tejidos tumorales LUAD en comparación con los tejidos normales adyacentes, y el nivel de KLF11 se correlacionó negativamente con la expresión de GPX4 pero se correlacionó positivamente con el pronóstico de los pacientes con LUAD. De hecho, la micromatriz de tejido es más adecuada en experimentos inmunohistoquímicos para detectar la expresión de proteínas en muchas muestras de tejido.
En conjunto, nuestros datos establecen a KLF11 como un regulador de la ferroptosis con potencial terapéutico y valor clínico como factor pronóstico.
Las líneas celulares LUAD humanas A549, PC9 y células de riñón embrionario humano 293 (HEK293T) se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM; Hyclone, Logan, UT, EE. UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10% (EveryGreen, Zhejiang, EE. China) y 100 U/mL de penicilina/estreptomicina/anfotericina B (Sangon Biotech, Shanghai, China). Todas las células se adquirieron del Banco de Células de la Academia China de Ciencias y se cultivaron en una incubadora a 37 °C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 %.
Se obtuvieron especímenes de archivo de 150 pacientes con LUAD en 2014 con consentimiento informado en el Departamento de Cirugía Torácica, Hospital Zhongshan, Universidad de Fudan. Todos los especímenes de estos pacientes fueron fijados en formalina e incluidos en parafina y tenían datos completos de clinicopatología y seguimiento. El estadio del tumor se determinó de acuerdo con la clasificación tumor/ganglio linfático/metástasis (TNM) utilizando la octava edición del Manual de estadificación del cáncer de la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC), y la clasificación patológica se basó en los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS). El seguimiento se completó en noviembre de 2019. La supervivencia global (SG) se definió como el intervalo entre la cirugía y la muerte o la última observación de los pacientes supervivientes. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación del Hospital Zhongshan, Universidad de Fudan (B2022-180R).
Topscience (Shanghái, China) proporcionó RSL3 (T3646), IKE (T1765), ferrostatina-1 (T6500), deferoxamina (DFO; T1637), cis-diaminodicloruro de platino (CDDP, T1564) y pemetrexed (Pem, T6226) . Los cuatro primeros compuestos se disolvieron en DMSO (Beyotime, Shanghai, China) y los dos últimos en PBS (Beyotime), según su solubilidad, y luego se almacenaron a -80 °C.
Para los ensayos de citotoxicidad, se sembraron 3000 células por pocillo por quintuplicado en placas de 96 pocillos y se incubaron durante 24 h. Las células se trataron con diferentes dosis de FIN o fármacos de quimioterapia durante 48 h según fuera necesario. Para los ensayos de proliferación, las células se sembraron a una densidad de 1000 células por pocillo y se incubaron durante 0, 24, 48, 72, 96 y 120 ha 37 °C. La viabilidad celular se midió con CCK-8 (Beyotime) según las instrucciones del fabricante.
El ensayo ChIP se realiza con el kit de IP de cromatina enzimática SimpleChIP® Plus (perlas magnéticas) (CST). En primer lugar, las células se entrecruzaron, se lisaron las membranas y se trataron con nucleasa microcócica para fragmentar la cromatina. Luego, la cromatina digerida y entrecruzada se incubó con Flag-Tag Antibody (CST). El anticuerpo contra la histona H3 (CST) y la IgG humana (CST) se usaron como control positivo y negativo, respectivamente. Los anticuerpos se enumeran en detalle en la Tabla complementaria S2. El ADN se eluyó de las perlas después de un lavado completo y se usó en qRT-PCR.
Para el establecimiento de líneas celulares (A549 y PC9) con sobreexpresión estable de KLF11 o GPX4, se obtuvieron los vectores de lentivirus KLF11 y GPX4 y las correspondientes secuencias de control negativo de Genechem Technology. Además, el vector viral para la desactivación de la expresión de KLF11 y las secuencias de control negativo también se obtuvieron de Genechem Technology (Tabla complementaria S3). El procedimiento resumido es el siguiente: se sembraron un total de 5 × 104 células (A549 y PC9) en placas de 12 pocillos. Veinticuatro horas más tarde, se añadió lentivirus a una MOI de 10, las células se cultivaron en el medio completo que contenía 5 mg/ml de polibreno durante 12 horas y el medio de cultivo se reemplazó por medio nuevo. A las 72 h después de la transducción, las células se propagaron posteriormente en el medio de selección que contenía puromicina 2,5 mM (Tecnología Hanyin).
Las células se sembraron en placas de 12 pocillos y se trataron con fármacos durante un tiempo apropiado al día siguiente, y luego se incubaron con 1 ml de medio fresco que contenía 5 μM de BODIPY 581/591 C11 (Invitrogen) durante 30 min. A continuación, las células se tripsinizaron, lavaron y resuspendieron en 0,5 ml de PBS para el análisis de citometría de flujo. Se analizó un mínimo de 20.000 células por condición. Se utilizó el software FlowJo para analizar los resultados (TreeStar, Woodburn, OR, EE. UU.).
La concentración de iones de hierro se detectó utilizando el kit de ensayo de hierro del fabricante (ab83366, Abcam), y el procedimiento del ensayo se basó en el protocolo según el kit.
La extracción de ARN y la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se realizaron como se describió anteriormente29. Brevemente, el ARN total se extrajo de tejidos o células con reactivo TRIzol (TIANGEN) y el ADNc se sintetizó con un kit de síntesis de ADNc de primera cadena Hifair II (gDNA Digester Plus, YEASEN, China). La qRT-PCR se realizó con una ejecución Hifair III One-Step en un sistema de PCR en tiempo real ABI QuantStudio 5 (Thermo Fisher, EE. UU.). Los valores del ciclo umbral (Ct) para cada gen se normalizaron con los de la actina como calibrador endógeno y se utilizó el método 2^(−△△CT) para el análisis cuantitativo. Los cebadores de cada gen fueron sintetizados por Sangon Biotech y se enumeran en la Tabla complementaria S1.
Brevemente, las células se lisaron en tampón RIPA (Beyotime) que contenía un cóctel inhibidor de proteasa y fosfatasa (Beyotime). Las proteínas obtenidas se cuantificaron con un kit de ensayo de proteínas BCA mejorado (Beyotime) y luego se hirvieron en tampón de carga 5xSDS-PAGE (EpiZyme, Shanghái, China) durante 10 min a 100 °C. A continuación, las proteínas se sometieron a SDS-PAGE para transferencia Western. Se usaron los siguientes anticuerpos: KLF11 (1:1000, #AF0315), GPX4 (1:1000, #DF6701) y SLC7A11 (1:1000, #DF12509) de Affinity Biosciences, ASCL4 (1:1000, #abs106075) de Absina y β-actina (1:10000, # D191047) de Sangon. Los escaneos sin recortar de las bandas se muestran en la Fig. 3 complementaria.
Para la tinción inmunohistoquímica se utilizaron el anticuerpo KLF11 (1:100, Affinity, n.° AF0315), el anticuerpo GPX4 (1:100, Affinity, n.° DF6701) y el sistema de detección GTVisionTM III (Gene Tech, Shanghái, China). La intensidad de la tinción positiva se midió como se describe30 y su expresión se clasificó en grupos altos y bajos según un valor de corte del 40%.
Clonamos la secuencia (−1000 ~ 200 pb alrededor del sitio de inicio de la transcripción), que contiene 5'-UTR, el primer exón y parte del primer intrón de la región promotora de GPX4, en el vector indicador de luciferasa dual phy-811@7 ( Tecnología Hanyin, Shanghái, China). Las células HEK293T se sembraron en una placa de 24 pocillos tratada con polilisina con una confluencia del 60 % al 70 %. Después de 24 h, las células se cotransfectaron con imitadores de KLF11 200 nM y 400 ng de los plásmidos de tipo salvaje o mutantes construidos como antes con Lipo8000 (Beyotime) como reactivo de transfección. Cuarenta y ocho horas más tarde, se recogieron las células y se realizaron los ensayos indicadores de luciferasa dual con un kit de ensayo de genes indicadores de luciferasa (Beyotime). Por último, la actividad de luciferasa se detectó con un espectrofotómetro Microplate (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.).
Las células cultivadas en placas de 6 cm se fijaron con una solución que contenía glutaraldehído al 2,5 %. Después de lavarlas tres veces en solución de tampón de fosfato 0,1 M (PBS, pH 7,4), las células se fijaron posteriormente con tampón de fosfato que contenía ácido ósmico al 1%, seguido de lavado en PBS 0,1 M (pH 7,4) otras tres veces. Las células se deshidrataron y embebieron, y luego se incubaron en un horno a 60 °C durante 48 h. Se prepararon secciones ultrafinas y se tiñeron con citrato de plomo y acetato de uranilo. Después de secar durante la noche, las secciones se examinaron con un microscopio electrónico de transmisión Hitachi (Hitachi, Japón).
Los experimentos con animales se realizaron de conformidad con las políticas del Comité de Ética Animal del Hospital Zhongshan. Seis millones de células A549 con diferentes tratamientos se resuspendieron en 300 μl de medio de cultivo y se inyectaron por vía subcutánea en el flanco izquierdo de ratones desnudos BALB/c macho de 4 semanas de edad. Los tumores de xenoinjerto se recolectaron 4 semanas después de la implantación. Se midieron los pesos de los tumores y se determinaron los volúmenes de los tumores como (largo x ancho2)/2.
Todos los análisis estadísticos se realizaron en el software GraphPad Prism (8.0) y el software R. Se realizaron las pruebas t de Student para datos no apareados y la prueba de Wilcoxon para comparar variables continuas entre dos grupos. El análisis de correlación entre KLF11 y GPX4 se realizó mediante pruebas de coeficiente de Spearman. El análisis de supervivencia se calculó mediante el método de Kaplan-Meier y la prueba de rango logarítmico. Se utilizó un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox para analizar los factores pronósticos independientes. Los resultados se presentan como medias y las barras de error representan la desviación estándar a menos que se indique lo contrario. Los valores de p fueron todos de dos colas, y p < 0,05 se consideró significativo: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ns, no significativo. Todos los experimentos en este estudio se repitieron tres veces.
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.
Los datos de RNA-Seq y los datos de origen numérico se han depositado en Figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21026443, https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22767161 y https:/ /doi.org/10.6084/m9.figshare.22820801). Otros datos de origen que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.
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Este estudio fue financiado por la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghai (No. 22ZR1411900).
Estos autores contribuyeron por igual: Guangyin Zhao, Jiaqi Liang, Guangyao Shan.
Departamento de Cirugía Torácica, Hospital Zhongshan, Universidad de Fudan, Shanghai, China
Guangyin Zhao, Jiaqi Liang, Guangyao Shan, Jie Gu, Fengkai Xu, Chunlai Lu, Teng Ma, Guoshu Bi, Cheng Zhan y Di Ge
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GZ, CZ y DG concibieron y diseñaron la investigación. GZ, JL y GS analizaron los datos y proporcionaron interpretación. JG, FX y CL recolectaron muestras de muestras. TM y GB brindaron soporte técnico. JG, JL y GS participaron en la evaluación de los resultados. GZ, JL y CZ escribieron, revisaron y revisaron el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito para su publicación.
Correspondencia a Cheng Zhan o Di Ge.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Este informe fue aprobado por el Comité de Ética del Comité de Ética de Investigación Clínica del Hospital Zhongshan, Universidad de Fudan (B2022-180R). Escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes.
Communications Biology agradece a Jiayi Wang y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Derrick Ong y Christina Karlsson Rosenthal.
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Reimpresiones y permisos
Zhao, G., Liang, J., Shan, G. et al. KLF11 regula la ferroptosis y la quimiosensibilidad del adenocarcinoma de pulmón mediante la supresión de GPX4. Comun Biol 6, 570 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04959-z
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Recibido: 25 enero 2023
Aceptado: 20 de mayo de 2023
Publicado: 29 mayo 2023
DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04959-z
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