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Sep 25, 2023

Evaluación de las respuestas inmunes humoral y celular inducidas por un cóctel de antígenos recombinantes del virus de la peste porcina africana fusionados con OprI en cerdos domésticos

Revista de virología

Virology Journal volumen 20, Número de artículo: 104 (2023) Citar este artículo

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La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad altamente mortal en los cerdos domésticos causada por el virus de la peste porcina africana (ASFV), para la cual actualmente no existe una vacuna comercial disponible. El genoma del virus de la peste porcina africana codifica más de 150 proteínas, algunas de las cuales se han incluido en vacunas de subunidades, pero solo inducen una protección limitada contra la exposición al virus de la peste porcina africana.

Para mejorar las respuestas inmunitarias inducidas por las proteínas ASFV, expresamos y purificamos tres proteínas de fusión, cada una de las cuales consta de lipoproteína bacteriana OprI, 2 proteínas/epítopos diferentes de ASFV y un epítopo universal de células T CD4+, a saber, OprI-p30-p54-TT modificado, OprI- pE248R-TT truncado con epítopos p72, y pEP153R-TT truncado con CD2v truncado con OprI. La actividad inmunoestimuladora de estas proteínas recombinantes se evaluó primero en células dendríticas. Luego, se evaluó en cerdos la inmunidad humoral y celular inducida por este cóctel de tres proteínas fusionadas con OprI formulado con adyuvante ISA206 (formulación O-Ags-T).

Las proteínas fusionadas con OprI activaron las células dendríticas con una secreción elevada de citoquinas proinflamatorias. Además, la formulación de O-Ags-T provocó un alto nivel de respuestas IgG específicas de antígeno y células T CD4+ y CD8+ secretoras de interferón-γ después de la estimulación in vitro. Es importante destacar que los sueros y las células mononucleares de sangre periférica de cerdos vacunados con la formulación O-Ags-T redujeron respectivamente la infección por el virus de la peste porcina africana in vitro en un 82,8 % y un 92,6 %.

Nuestros resultados sugieren que el cóctel de proteínas fusionadas con OprI formulado con el adyuvante ISA206 induce fuertes respuestas inmunitarias humorales y celulares específicas para el virus de la peste porcina africana en cerdos. Nuestro estudio proporciona información valiosa para el desarrollo posterior de vacunas de subunidades contra la peste porcina africana.

La peste porcina africana (PPA), es una enfermedad viral porcina altamente contagiosa, hemorrágica y devastadora que causa graves pérdidas económicas a nivel mundial, para la cual no existe una vacuna efectiva [1]. El agente causante de la peste porcina africana, el virus de la peste porcina africana (ASFV), es un virus de ADN con envoltura grande que pertenece al género Asfivirus dentro de la familia Asfarviridae [2]. El genoma de ASFV varía en longitud entre aproximadamente 170 y 193 kbp y codifica más de 150 marcos de lectura abiertos [3]. Dependiendo de la secuencia del gen B646L (que codifica la proteína p72 de la cápside), el VPPA se clasifica actualmente en 24 genotipos diferentes [4]. La peste porcina africana se informó por primera vez en Kenia y ha sido endémica en el África subsahariana durante muchos años [5]. En 2007, se introdujo en Georgia y desde entonces se ha extendido a muchos países de Europa del Este [6]. En 2018, ASF surgió en China y se ha extendido rápidamente a muchas regiones del país y otros países asiáticos [7]. La peste porcina africana ha matado o sacrificado a millones de cerdos en un intento por controlar la enfermedad. Actualmente, la peste porcina africana todavía prevalece en China y continúa siendo una seria amenaza para la industria porcina [8]. Por lo tanto, se necesita con urgencia una vacuna segura y eficaz contra la peste porcina africana.

Se han evaluado varios enfoques para el desarrollo de vacunas contra la peste porcina africana [9]. Sin embargo, todos los intentos de desarrollar vacunas seguras y eficaces contra la peste porcina africana no tuvieron éxito [9]. Las vacunas que contienen virus inactivados no han conferido protección hasta el momento [10]. Se ha demostrado que las cepas de ASFV atenuadas o de baja virulencia provocan respuestas inmunitarias protectoras contra las cepas de ASFV virulentas en cerdos [11,12,13,14] pero los cerdos vacunados suelen experimentar efectos secundarios adversos, como viremia crónica [15]. Además, la aplicación de ASFV vivo atenuado plantea serias preocupaciones de seguridad. Por el contrario, a pesar de la inducción de solo una protección parcial contra la exposición al virus de la peste porcina africana, las vacunas de subunidades del virus de la peste porcina africana ofrecen una opción más segura [16]. Una combinación de p30 y p54 recombinantes, o una proteína quimérica p54/30, protegió a los animales de enfermedades graves después de la exposición a ASFV [17, 18]. La inmunización de cerdos con CD2v recombinante indujo la producción de anticuerpos protectores y protegió a 2/3 de los animales contra la exposición a ASFV [19]. Más recientemente, se ha demostrado que pEP153R es importante para la protección contra la infección homóloga por ASFV [20]. Curiosamente, los cerdos inmunizados con una combinación de p30, p72, p54 y p22 recombinantes produjeron anticuerpos neutralizantes, pero solo mostraron un inicio tardío de la enfermedad después del desafío [21]. La creciente evidencia muestra que las respuestas inmunes celulares también juegan un papel clave en la defensa contra la infección por ASFV [22, 23]. La inmunización con una biblioteca de expresión de ADN de ASFV protegió al 60 % de los cerdos contra la exposición a ASFV debido a las células T CD8+ específicas de antígeno [22], lo que reveló la existencia de antígenos protectores potenciales. Juntos, los enfoques actuales de vacunas de subunidades sugieren la importancia de seleccionar antígenos ASFV adecuados y mejorar la inmunidad humoral y celular protectora.

La principal lipoproteína I de la membrana externa (OprI) de Pseudomonas aeruginosa es un ligando del receptor tipo Toll (TLR)-2 [24]. Es capaz de desencadenar que las células dendríticas (DC) secreten citocinas proinflamatorias in vivo, que modulan indirectamente las respuestas inmunitarias adaptativas [25]. OprI actúa como un adyuvante natural que provoca potentes respuestas humorales y de células T citotóxicas contra péptidos/proteínas cuando se fusiona con él [26]. La aplicación de OprI en proteínas de fusión se ha extendido a los antígenos codificados por B646L y G1340L de ASFV, y la proteína resultante fue capaz de inducir linfocitos T citotóxicos [27, 28]. Las diferentes funciones inmunitarias de OprI, incluida la promoción de las respuestas Th1/Th2, se atribuyen a la activación de la señalización de TLR-2 [29]. La actividad inmunomoduladora de las fusiones OprI también se ha utilizado en el desarrollo de vacunas [30] y, recientemente, se demostró que la inmunización de ratones con antígenos fusionados con OprI inhibe notablemente la transmisión vertical de Neospora caninum y la mortalidad posnatal [31].

En este estudio, investigamos las respuestas inmunitarias humorales y celulares inducidas por un cóctel de antígenos ASFV recombinantes fusionados con OprI y sus efectos sobre la infección por ASFV. Diseñamos tres proteínas de fusión OprI recombinantes y cada proteína contiene 2 proteínas/epítopos de ASFV diferentes fusionados con el extremo C-terminal de OprI y el extremo N-terminal de un epítopo universal de células T CD4+. La actividad inmunoestimuladora de estas proteínas recombinantes se evaluó utilizando células dendríticas derivadas de médula ósea murina (BMDC). A continuación, se evaluaron en cerdos las respuestas inmunitarias humoral y celular inducidas por un cóctel de estas tres proteínas de fusión OprI. Los efectos de los sueros inmunes y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de cerdos inmunizados sobre la infección por ASFV se determinaron in vitro para proporcionar evidencia preliminar antes de proceder a los experimentos de desafío en cerdos. Creemos que nuestro trabajo contribuirá al desarrollo de una nueva vacuna de subunidades contra la peste porcina africana.

Los macrófagos alveolares porcinos primarios (MAP) se recolectaron de cerdos Large White (10-20 kg) que dieron negativo para el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, el virus de la peste porcina clásica, el virus de la peste porcina africana y el virus de la pseudorrabia. Las PAM se cultivaron en medio RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific, MA, EE. UU.) que contenía suero fetal bovino al 15 % (FBS, Thermo Fisher Scientific), a 37 °C con 5 % de CO2. Las cepas de ASFV China/Sichuan/2019 (CN/SC/19) se obtuvieron del Laboratorio Regional de Peste Porcina Africana, Instituto de Investigación Veterinaria de Lanzhou (LVRI, Academia China de Ciencias Agrícolas, China). La reserva de ASFV CN/SC/19 utilizada para el ensayo de neutralización se propagó y tituló en PAM.

Las secuencias de aminoácidos de las proteínas/epítopos utilizados para construir proteínas de fusión se muestran en la Tabla 1. La secuencia de aminoácidos de P. aeruginosa OprI se derivó de la entrada X13748.1 de GenBank y todas las proteínas/epítopos del virus de la peste porcina africana del aislado China/2018 del virus de la peste porcina africana. /AnhuiXCGQ se recuperaron de la entrada MK128995.1 de GenBank. Todos los epítopos de p72 seleccionados, validados mediante experimentos, se obtuvieron de la base de datos de epítopos inmunitarios (IEDB [www.iedb.org]). Se seleccionaron dominios extracelulares o intracelulares de pE248R, CD2v y pEP153R para construir proteínas de fusión después del análisis de motivos de proteínas usando SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/). Como se muestra en la Fig. 1, se construyeron tres proteínas de fusión OprI, que incluyen p54-TT modificada con OprI-p30, epítopos OprI-p72-△pE248R-TT y OprI-△CD2v-△pEP153R-TT y se denominaron OPMT, OPET y OCET ("△" significa truncado). Paralelamente, p54 modificado con p30, epítopos p72-△pE248R y △CD2v-△pEP153R se diseñaron para servir como controles y se denotaron como PM, PE y CE. Las secuencias de aminoácidos de todas las proteínas de fusión se convirtieron en secuencias de nucleótidos, que se sintetizaron químicamente (GenScript, NanJing, China) y se clonaron en sitios NdeI-XhoI del vector de expresión pET30a (+) (Novagen, San Diego, CA, EE. UU.), albergando una etiqueta de histidina de 6 ×. La integridad y fidelidad de los plásmidos de expresión construidos se confirmaron mediante secuenciación de ADN.

Diagrama esquemático de seis proteínas de fusión, denominadas OPMT, OPET, OCET, PM, PE y CE. OprI, secuencia completa de lipoproteína I bacteriana; p30, secuencia completa de p30; p54-1 y p54-2 representan respectivamente (Met1-Thr29) y (Ser53-Leu184) de p54; p72-E1, p72-E2, p72-E3 y p72-E4 representan respectivamente (Gln364-Pro395), (Ala518-Lys552), (Tyr179-Leu210) y (Leu242-Pro273) de p72; △pE248R, pE248R (Met1-Lys198); △CD2v, CD2v (Asp17-Tyr206); △pEP153R, pEP153R (Asn49-Lys158); TT-P2, un epítopo universal de células T CD4+; línea amarilla gruesa, enlazador 1" (GGGGS)3"; delgada línea amarilla, enlazador 2 "PG"

Cada plásmido de expresión se transformó en células competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (Takara, Dalian, China) y las cepas positivas resultantes se indujeron con isopropiltio-β-galactósido 1 mM a una densidad óptica (DO) de 0,6 a 600 nm. para la expresión de las proteínas de fusión. OPMT, OPET y OCET se aislaron de las membranas externas bacterianas como se describió anteriormente [32]. Brevemente, los sedimentos bacterianos se resuspendieron en tampón Tris-EDTA (pH 8,0) que contenía 2,5 mg/ml de lisozima (Genscript) y se incubaron durante 35 min en hielo. Después de la adición de un volumen igual de sarkosyl (2 %, p/v), la mezcla se ultrasonicó y luego se ultracentrifugó a 100 000 × g durante 2 h a 4 °C para obtener gránulos de membrana externa insolubles. Después de tratarse con cloroformo/metanol (2:1, v/v) para extraer los lípidos redundantes, las membranas externas se solubilizaron en clorhidrato de guanidina 6 M y posteriormente se purificaron mediante cromatografía de afinidad con Ni en presencia de urea 8 M. Por el contrario, PM, PE y CE se purificaron de los cuerpos de inclusión de sus bacterias inducidas bajo el mismo proceso cromatográfico. Todas las proteínas de fusión recombinantes eluidas se replegaron mediante diálisis. Luego se eliminó la endotoxina por separación de fases usando Triton X-114. El nivel de endotoxina en las muestras de proteína purificada se determinó con un kit de ensayo de endotoxina LAL cromogénica ToxinSensor™ (Genscript).

Se sometieron cantidades aproximadamente iguales de cada proteína recombinante a SDS-PAGE al 12%. El gel se tiñó con azul de Coomassie o se transfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno (Milipore, San Diego, CA, EE. UU.). Las membranas se bloquearon en leche descremada al 5 % durante 2 h a temperatura ambiente (TA), seguido de incubación con anticuerpo monoclonal (mAb) antihistidina (dilución 1:5000, Abcam, Cambridge, Reino Unido) o suero porcino anti-VPPA (1 :300 dilución, Instituto Chino de Control de Drogas Veterinarias, Beijing, China) durante la noche a 4 °C. Después de lavar cinco veces con Tween-20 al 0,05 % en PBS (PBST), las membranas se incubaron con IgG anti-ratón de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (dilución 1:5000, Abcam) o IgG anti-cerdo de cabra conjugada con HRP. (dilución 1:5000, Abcam) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar con PBST, las transferencias se revelaron con reactivo de quimioluminiscencia mejorado (Thermo Fisher Scientific).

Todas las proteínas de fusión recombinantes se evaluaron para la estimulación de DC. Los BMDC se generaron como se describió anteriormente [33]. Las BMDC se recolectaron y ajustaron a una densidad de 5 × 105 células/mL, y luego se cultivaron en presencia de cada proteína (1 o 5 µg/ml), lipopolisacárido (LPS, 0,1 µg/ml) o medio durante 24 h. El factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y la interleucina-12p70 (IL-12p70) se midieron en los sobrenadantes de cultivo mediante kits ELISA comerciales (Neobioscience, ShenZhen, China).

Dos grupos de antígenos, uno formado por OPMT (150 μg/mL), OPET (150 μg/mL) y OCET (300 μg/mL) y el otro por PM (150 μg/mL), PE (150 μg/mL) y CE (300 μg/ml), se emulsionaron respectivamente con un volumen igual de Montanide ISA206 (ISA206, SEPPIC Inc., París, Francia) para formar mezclas de agua en aceite en agua (W/O/W) , a saber, formulación O-Ags-T (OPMT + OPET + OCET + ISA206) ​​y formulación Ags (PM + PE + CE + ISA206). Se obtuvo un total de 11 cerdos exogámicos sanos de seis semanas de edad de una granja local y se alojaron en grupo en el Centro de Investigación de Animales Grandes de LVRI. Los protocolos de cuidado de los animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del LVRI. Todos los cerdos se dividieron aleatoriamente en tres grupos (n = 4 para el grupo 1 y el grupo 2, n = 3 para el grupo de control) y se inmunizaron dos veces por vía intramuscular a intervalos de 3 semanas. Los animales del grupo 1 y del grupo 2 se inmunizaron con formulación de O-Ags-T y formulación de Ags (2 ml/cerdo), respectivamente. Los cerdos de control recibieron un volumen igual de PBS formulado con ISA206. Se extrajo sangre a todos los cerdos a los 0, 14, 21, 35 y 42 días después de la vacunación (dpv).

Las respuestas de IgG específicas de antígeno en los sueros de los cerdos vacunados se midieron mediante ELISA indirecto. Brevemente, las placas de 96 micropocillos (Costar, Cambridge, MA, EE. UU.) se recubrieron previamente con p30 recombinante (0,125 µg/mL), p54 modificado (0,5 µg/mL), p72 (1 µg/mL), △pE248R (1 µg/mL), △CD2v (2 µg/mL) y △pEP153R (2 µg/mL) durante la noche a 4 °C y bloqueado con leche descremada al 5 % durante 2 h a 37 °C. Se añadieron muestras de suero (diluciones 1:100) de cerdos inmunizados a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Paralelamente, se establecieron controles en blanco y negativos. Después de cinco lavados con PBST, las placas se incubaron con IgG-HRP anti-cerdo (diluciones 1:10 000) durante 1 hora a 37 °C. Después de una serie de lavados finales, se desarrolló el color con sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina durante 15 min a 37 °C y se detuvo con H2SO4 2 M. La DO a 450 nm (OD450) de cada pocillo se determinó utilizando un lector de microplacas (Thermo Fisher Scientific).

Se recogieron muestras de sangre periférica de cada cerdo inmunizado a los 42 dpv en tubos vacutainer con heparina sódica. Las PBMC se aislaron de sangre heparinizada utilizando una solución de separación de linfocitos (Dakewei, Shenzhen, China) y se tiñeron con 5(6)-carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster (CFSE, Invitrogen, San Diego, CA, EE. UU.) para la detección de proliferación celular. Brevemente, se incubaron un total de 2 × 106 PBMC con 1 ml de solución de marcaje CFSE (1,25 µM) durante 10 min a 37 °C. Después de lavar tres veces con PBS, las células se resuspendieron en RPMI-1640 que contenía FBS al 5 % a 1 × 106 células/ml y se cultivaron en placas de 24 pocillos (1 × 106 células/pocillo, Corning, NY, EE. UU.) en presencia de de ASFV inactivado por calor (105 dosis hemadsorbentes al 50% (HAD50)) durante 72 h. Paralelamente, las células no teñidas y las células teñidas tratadas con concanavalina A (5 μg/mL, Dakewei) o medio se establecieron como controles en blanco, positivo y negativo, respectivamente. Las células se recogieron para el análisis de proliferación mediante citometría de flujo, indicado por la disminución de la intensidad de fluorescencia CFSE (CFSE-baja).

Las PBMC se obtuvieron como se describe anteriormente y se sembraron en placas de 24 pocillos (1 × 106 células 1 ml/pocillo). Después de agregar ASFV inactivado (105 HAD50) a cada pocillo, las células se cultivaron durante 40 h y luego se incubaron con monensina (1,7 μg/mL, Biolegend, San Diego, CA, EE. UU.) durante 8 h más. Paralelamente, las PBMC incubadas con un cóctel de activación celular (dilución 1:1000, Biolegend) o medio se establecieron como controles positivos y negativos. Las células de cada pocillo se recogieron y se tiñeron con mAb anti-CD3 conjugado con colorante PerCP/cianina 5.5, anti-CD4 conjugado con isotiocianato de fluoresceína y anti-CD8α conjugado con ficoeritrina (todos de BD Biosciences, San Diego, EE. UU.) durante 30 min. a 4 °C. Después de tratar con los reactivos Fix y Perm (BD Biosciences), las células se tiñeron con mAb anti-IFN-γ conjugado con Alexa Fluor 647 (AF647) (BD Biosciences) durante 30 min. Las células se lavaron con PBS y se sometieron a análisis de citometría de flujo. Las células se seleccionaron para seleccionar linfocitos T CD3+, dentro de los cuales se determinó adicionalmente la puerta para las células T CD4+ y CD8+. Se analizaron los porcentajes de células T CD4+ y CD8+ productoras de IFN-γ (IFN-γ+) para cada muestra.

La actividad de neutralización de los sueros de cada grupo recolectados en 0 (sueros preinmunes) y 42 dpv (sueros inmunes) se evaluó como se describió previamente [34]. ASFV CN/SC/19 (multiplicidad de infección (MOI) = 0,01, calculada por PAM para la inoculación) se mezcló con 200 μL de sueros inactivados por calor (dilución: 1/5) o un volumen igual de medio (control negativo) y se incubó. toda la noche a 37 °C. La mezcla de sueros/VPPA se inoculó en monocapas de PAM en placas de 24 pocillos. Después de la adsorción del virus durante 1 h a 37 °C, se retiraron los inóculos virales y se añadió RPMI-1640 con FBS al 5 % (500 μL/pocillo) con una incubación adicional de 48 h. Para cada muestra, se incluyeron tres réplicas. El número de copias del genoma de ASFV en cada muestra se determinó mediante kits de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para ASFV (Centro de Productos de Diagnóstico, LVRI). El porcentaje de neutralización para cada muestra de suero se calculó de la siguiente manera:

Neutralización (%) = 100 – 100 × número de copias de ASFV en presencia de suero inmunitario/número de copias de ASFV en presencia de suero preinmune.

La actividad de neutralización de los sueros inmunes a los 42 dpv también se evaluó mediante análisis de inmunofluorescencia indirecta. Los sueros se incubaron con ASFV y se inocularon en monocapas de PAM como se describe anteriormente. Después de incubar durante 48 horas, las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 1 hora a 4 °C. Después de la permeabilización con Triton X-100 al 0,25 % durante 10 min, las células se bloquearon con BSA al 5 % durante 1 h y luego se incubaron con mAb anti-p30 (diluciones 1:300, producidas por nuestro laboratorio) durante 1 h. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con IgG anti-ratón de cabra conjugado con isotiocianato de tetraetil rodamina (TRITC) (diluciones 1:500, Abcam) durante 1 h, seguido de tinción con DAPI (Thermo Fisher Scientific) durante 5 min. Después de tres lavados con PBS, el registro de imágenes se realizó con un microscopio de fluorescencia (Leica, Wetzlar, Alemania).

Las PBMC de cerdos inmunizados a los 42 dpv se obtuvieron como se describe anteriormente y se cultivaron en placas de 24 pocillos (500 μL/pocillo) a 1 × 106 células/mL y se infectaron con ASFV CN/SC/19 (MOI = 0,01) durante 48 h a 37 °C. Las PBMC de cerdos sanos no inmunizados inoculados con cantidades iguales de ASFV sirven como control. Para cada muestra se realizaron tres repeticiones. El número de copias del genoma de ASFV en cada muestra se determinó mediante kits de qPCR para ASFV, comparándolos con los que aparecían en PBMC de cerdos no inmunizados. El porcentaje de inhibición de la infección por ASFV para cada grupo de PBMC se calculó de la siguiente manera:

Inhibición (%) = 100 – 100 × número de copias de ASFV en PBMC de cerdos inmunizados/número de copias de ASFV en PBMC de cerdos no inmunizados.

Todos los experimentos se repitieron tres veces con resultados consistentes. Los datos de las figuras se expresan como media ± desviación estándar (SD), como se indica en las leyendas de las figuras. La significación estadística de las diferencias entre los grupos se determinó mediante análisis de varianza unidireccional y pruebas t de Student (software GraphPad Prism, San Diego, CA, EE. UU.). No se estableció significación (NS) entre los grupos en P > 0,05. * P < 0,05, ** P < 0,01 y *** P < 0,001 se consideraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.

El vector de expresión que contiene los genes que codifican cada proteína de fusión se construyó y transformó con éxito en E. coli para la expresión de proteínas. Estas proteínas recombinantes marcadas con His se purificaron mediante cromatografía de afinidad con Ni y se verificaron mediante SDS-PAGE (Fig. 2A). Las bandas correspondientes a OPMT, OPET, OCET, PM, PE y CE fueron claramente visibles después de la tinción con azul de Coomassie. Las proteínas recombinantes purificadas también se confirmaron mediante transferencia Western, utilizando un mAb antihistidina (Fig. 2B) y suero porcino anti-VPPA (Fig. 2C). Después de la eliminación de la endotoxina, la concentración de endotoxina en las proteínas recombinantes purificadas se detectó mediante ensayos de lisado de amebocitos de Limulus y se demostró que estaba por debajo de 0,1 UE/µg.

Identificación de proteínas de fusión recombinantes purificadas por SDS-PAGE y transferencia Western. Un análisis SDS-PAGE de proteínas recombinantes purificadas. Carril M, marcadores de peso molecular; carril 1, OPMT; carril 2, OPET; carril 3, OCET; carril 4, PM; carril 5, PE; carril 6, CE. Confirmación mediante transferencia Western de proteínas recombinantes purificadas con mAb anti-polihistidina (B) o suero porcino anti-VPPA (C) como anticuerpo primario y los anticuerpos secundarios correspondientes. Los contenidos de los carriles son los mismos que en el panel (A)

La actividad inmunoestimuladora de las proteínas recombinantes se evaluó en BMDC. Los niveles de TNF-α (Fig. 3A) e IL-12p70 (Fig. 3B) en los sobrenadantes de cultivo de BMDC incubados con 1 μg/mL o 5 μg/mL de OPMT, OPET y OCET fueron significativamente más altos que los de PM , PE y CE. Entre todas las proteínas recombinantes, OPMT indujo los niveles más altos de TNF-α e IL-12p70 en cualquiera de las concentraciones. Estos resultados sugieren que las proteínas fusionadas con OprI pueden inducir una estimulación fuerte y específica de las CD.

Citocinas secretadas por las CD después de la estimulación. Niveles de TNF-α (A) e IL-12p70 (B) en sobrenadantes de cultivo después de la estimulación de BMDC con cada proteína recombinante (1 o 5 μg/mL), LPS (0,1 μg/mL) o medio (control) durante 24 h. Todos los datos se muestran como media ± SD (n = 3); NS = P > 0,05; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001

Las respuestas de IgG en cerdos inmunizados se midieron mediante ELISA indirecto. Como se muestra en la Fig. 4A-E, el nivel de IgG específica de p30-, p54-, p72-, pE248R-, CD2v- y pEP153R fue detectable a los 14 dpv en el suero de los cerdos que recibieron la formulación O-Ags-T. o formulación de Ags y aumentó a un nivel más alto después de una vacunación de refuerzo (a los 35 y 42 dpv). Por el contrario, los seis tipos de IgG específicas de antígeno eran apenas detectables en los sueros de todos los cerdos a 0 dpv y de los cerdos inmunizados con PBS en cualquier momento. En comparación con los cerdos que recibieron la formulación de Ags, los cerdos inmunizados con la formulación de O-Ags-T produjeron niveles similares de IgG específicas de p30 y p54, sin diferencias significativas entre ellos en el mismo punto temporal (P > 0,05). Sin embargo, la inmunización de cerdos con la formulación O-Ags-T indujo niveles significativamente más altos de IgG específicas de p72-, pE248R-, CD2v- y pEP153R a los 35 y 42 dpv, en relación con la inmunización con la formulación Ags. En conjunto, los datos indican que la inmunización con un cóctel de proteínas de fusión OprI formuladas con ISA206 provocó eficazmente respuestas de IgG específicas de antígeno de ASFV en cerdos.

Detección de IgG específica de antígeno. Respuestas de IgG a p30 (A), p54 (B), p72 (C), pE248R (D), CD2v (E) y pEP153R (F) en los sueros de cada cerdo inmunizado a los 0, 14, 21, 35 y 42 dpv fueron detectados por ELISA indirecto, con diluciones de suero de 1:100 y diluciones de IgG-HRP anti-cerdo de cabra de 1:10,000. Los resultados se expresan como DO450 (media ± SD). NS = P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01; *** P < 0,001

Para determinar las respuestas inmunitarias celulares en cerdos inmunizados, se evaluó la proliferación de linfocitos en PBMC de cada cerdo a los 42 dpv mediante marcaje con CFSE. Como se muestra en la Fig. 5A, los cerdos que recibieron la formulación O-Ags-T exhibieron el mayor porcentaje de linfocitos bajos en CFSE entre los tres grupos cuando se estimularon con ASFV inactivado, lo que indicó la mayor proliferación de linfocitos. Los cerdos inmunizados con la formulación de Ags mostraron una proliferación moderada de linfocitos después de la estimulación. Por el contrario, no se detectó proliferación de linfocitos en PBMC de cerdos inmunizados con PBS. Los porcentajes de linfocitos proliferativos se determinaron en tres experimentos independientes (Fig. 5B). La inmunización de cerdos con formulación O-Ags-T indujo un porcentaje significativamente mayor de proliferación de linfocitos que la inmunización con formulación Ags o PBS (P < 0,001).

Proliferación de linfocitos en PBMC de cerdos inmunizados después de la estimulación in vitro con ASFV inactivado. A El porcentaje de linfocitos bajos en CFSE (representados por P2) detectados por citometría de flujo en PBMC de cerdos inmunizados a los 42 dpv después de teñir con CFSE e incubar con ASFV inactivado, medio (control negativo) o concanavalina A (control positivo). El grupo 1 y el grupo 2 representan respectivamente cerdos inmunizados con formulación O-Ags-T o formulación Ags. B Porcentajes calculados de linfocitos proliferativos basados ​​en linfocitos bajos en CFSE en PBMC de tres experimentos separados. Los gráficos muestran resultados medios con barras de error que indican la DE; **P < 0,01; *** P < 0,001

Para investigar más a fondo los tipos de linfocitos reactivos, se determinó mediante citometría de flujo el porcentaje de células T IFN-γ+ CD4+ y CD8+ en PBMC de cerdos inmunizados a los 42 dpv. Las células T CD3+, CD4+ y CD8+ se seleccionaron una por una (Archivo adicional 1: Fig. S1). Después de la estimulación con ASFV inactivado, las PBMC de todos los cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T mostraron altos porcentajes de células T IFN-γ+ CD4+ e IFN-γ+ CD8+ (Archivos adicionales 2 y 3: Figs. S2 y S3). Los porcentajes de células T IFN-γ+ CD4+ e IFN-γ+ CD8+ en cada grupo se determinaron en tres experimentos independientes (Fig. 6A y B). Los porcentajes de células T IFN-γ+ CD4+ e IFN-γ+ CD8+ de cerdos que recibieron la formulación O-Ags-T fueron significativamente más altos que los de los otros grupos, lo que indica respuestas inmunitarias mediadas por células T sólidas. El porcentaje promedio de células T CD8+ IFN-γ+ de los cerdos que recibieron la formulación O-Ags-T fue aproximadamente dos veces mayor que el de las células T CD4+ IFN-γ+, lo que indica respuestas de células T CD8+ específicas de ASFV más fuertes. Estos datos demuestran que la inmunización de cerdos con el cóctel de proteínas de fusión OprI provocó respuestas inmunitarias celulares específicas de ASFV sólidas, que pueden contribuir a la defensa contra la infección por ASFV.

Células T productoras de IFN-γ en PBMC de cerdos inmunizados a los 42 dpv. El porcentaje de células T CD4+ secretoras de IFN-γ (A) y células T CD8+ secretoras de IFN-γ (B) en PBMC de cerdos inmunizados a los 42 dpv después de la estimulación in vitro con ASFV inactivado, medio (control negativo) o una célula cóctel de activación (control positivo). Los gráficos muestran los resultados medios con barras de error que indican la DE. NS = P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01; *** P < 0,001

Para analizar la actividad neutralizante de ASFV de los sueros inmunes, se determinó su efecto sobre la proliferación de ASFV en monocapas de PAM. En el primer enfoque, el número de copias del genoma de ASFV en cada muestra se determinó mediante qPCR. Como se muestra en la Fig. 7A, en comparación con el grupo de control, los sueros de los cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T o la formulación Ags redujeron significativamente el número de copias del genoma del ASFV (P < 0,001), lo que indica la inhibición de la proliferación del ASFV en las PAM. Por el contrario, los sueros de cerdos inmunizados con PBS y todos los cerdos antes de la inmunización no mostraron capacidad para reducir el número de copias del genoma de ASFV. En base a los resultados, se calcularon los porcentajes de ASFV neutralizados por los sueros de cerdos inmunizados con formulación O-Ags-T o formulación Ags. Los porcentajes medios de virus neutralizados por los sueros de los cerdos que recibieron la formulación O-Ags-T o la formulación Ags fueron del 81,6% y 82,8% respectivamente, sin diferencia significativa entre ellos (P > 0,05) (Fig. 7B).

Neutralización de la infección por ASFV por los sueros de cerdos inmunizados a los 42 dpv. A El número de copias del genoma del virus de la peste porcina africana en PAM infectados por el virus de la peste porcina africana (MOI = 0,01) preincubados con sueros preinmunes inactivados por calor, sueros inmunes (ambos a una dilución de 1:5) o volumen igual de medio (control negativo), respectivamente. B El porcentaje de neutralización de ASFV por los sueros de cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T o la formulación Ags a los 42 dpv. Se muestran los resultados medios con el error estándar. NS = P > 0,05; *** P < 0,001

La actividad neutralizadora del virus de la peste porcina africana de los sueros inmunes también se determinó a partir de la presencia reducida de virus de la peste porcina africana en las PAM mediante inmunofluorescencia indirecta. En contraste con la incubación de ASFV sin sueros (control negativo), se demostró que la incubación de ASFV con sueros de cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T o la formulación Ags reduce notablemente la intensidad de TRITC y el número de células positivas para TRITC después de la infección (Fig. 8). Por el contrario, no hubo alteración visible en los PAM infectados con ASFV preincubados con sueros inmunizados con PBS. Estos resultados confirmaron que los anticuerpos inducidos por la formulación de O-Ags-T o la formulación de Ags en cerdos eran capaces de neutralizar la infectividad de ASFV in vitro.

Identificación por inmunofluorescencia indirecta de PAM infectados con ASFV. Los PAM infectados con ASFV (MOI = 0.01) preincubados con sueros inmunes inactivados por calor (42 dpv) del grupo 1 (formulación O-Ags-T), grupo 2 (formulación Ags) y grupo o medio PBS (control negativo) fueron sometidos a Ensayo de inmunofluorescencia indirecta, con mAb anti-p30 como anticuerpo primario y IgG-TRITC anti-ratón de cabra como anticuerpo secundario. DAPI indica la tinción del núcleo. El panel inferior representa la fusión de los 2 canales de arriba

Las PBMC aisladas de cerdos inmunizados a los 42 dpv se infectaron con ASFV para investigar sus efectos sobre la infección por ASFV. Las PBMC de cerdos no inmunizados o inmunizados con PBS mostraron un mayor número de copias del genoma de ASFV después de la infección, sin diferencias significativas entre ellas (P > 0,05) (Fig. 9A). A diferencia de las PBMC de cerdos no inmunizados, el número de copias del genoma del ASFV disminuyó significativamente en las PBMC de cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T o la formulación Ags (P < 0,001), lo que indica sus efectos inhibitorios sobre la infección por el ASFV in vitro. Sobre la base de los resultados anteriores, se calculó el porcentaje de inhibición de la infección por ASFV en PBMC de estos dos grupos y se muestra en la Fig. 9B. Las PBMC de cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T inhibieron la infección por ASFV in vitro hasta en un 92,6 %, que fue significativamente mayor que la de los cerdos inmunizados con la formulación Ags (p < 0,001). Esto sugiere una mejora del efecto antiviral de las respuestas inmunes celulares después de la inmunización de cerdos con el cóctel de proteínas fusionadas con OprI.

Inhibición de la infección por ASFV en PBMC de cerdos inmunizados a los 42 dpv. A Número de copias del genoma de ASFV en PBMC de cerdos no inmunizados o cerdos inmunizados a los 42 dpv infectados con ASFV (MOI = 0,01). B Porcentajes de inhibición de ASFV en PBMC de cerdos inmunizados con formulación O-Ags-T o formulación Ags a los 42 dpv. Se muestran los resultados medios con el error estándar. NS = P > 0,05; *** P < 0,001

El desarrollo de vacunas seguras y eficaces contra la peste porcina africana es un gran desafío debido a la naturaleza compleja del virus [8]. Entre los enfoques para desarrollar vacunas contra la peste porcina africana, las cepas vivas atenuadas del virus de la peste porcina africana generadas por la eliminación de un gen específico parecen ser muy prometedoras debido a su inducción de una sólida inmunidad protectora contra el desafío del virus de la peste porcina africana, pero este enfoque aún presenta el riesgo de una reversión a la virulencia [35]. . Por el contrario, las vacunas basadas en subunidades contra el virus de la peste porcina africana evitan estos posibles problemas y parecen ser más fáciles de fabricar que las vacunas atenuadas contra el virus de la peste porcina africana [36]. Se han evaluado diferentes tipos de vacunas basadas en subunidades contra la peste porcina africana en cerdos con exposición al virus de la peste porcina africana y algunas de ellas confirieron un cierto grado de protección [17,18,19, 36], mientras que algunas no proporcionaron protección, aunque más vacunas contra el virus de la peste porcina africana se incluyeron antígenos en las vacunas [21, 37]. Estos resultados resaltan la importancia de seleccionar antígenos ASFV adecuados y mejorar la inmunidad celular y humoral protectora en el desarrollo de vacunas de subunidades contra ASF.

En el presente estudio, se construyeron y usaron tres proteínas de fusión recombinantes basadas en p30, p54, p72, pE248R, CD2v y pEP153R para preparar un cóctel de vacuna contra la PPA. Entre las proteínas seleccionadas del virus de la peste porcina africana, p30, p54, p72 y CD2v se han estudiado ampliamente en vacunas de subunidades y se ha demostrado que inducen respuestas inmunitarias protectoras o anticuerpos neutralizantes contra el virus de la peste porcina africana. Se demostró que las otras dos proteínas de ASFV, pE248R y pEP153R, son antígenos protectores potenciales en experimentos de desactivación genética [20, 38]. Debido a la dificultad en la expresión de proteínas de membrana y proteínas de más de 100 kDa en E. coli [39], todas las secuencias de aminoácidos de las proteínas de membrana (p54, pE248R, CD2v, pEP153R) se modificaron o truncaron de acuerdo con el análisis de motivos de proteínas por SMART y se usaron los epítopos de p72 identificados en lugar de la secuencia completa de p72. Para mejorar las respuestas inmunes humorales y celulares inducidas por las proteínas ASFV, se incluyeron OprI y el epítopo universal P2 de células T CD4+ (aa 830–844) del toxoide tetánico (TT-P2) para construir cada proteína de fusión recombinante. Por un lado, OprI, dirigido a TLR-2, puede ser absorbido de manera eficiente por monocitos/macrófagos y mejorar las respuestas inmunitarias específicas de antígeno [26]. Por otro lado, se ha demostrado que TT-P2 mejora la inmunogenicidad de una vacuna peptídica para la malaria [40] y una vacuna basada en epítopos para el rotavirus [41]. El objetivo principal de nuestro estudio es mejorar las respuestas inmunitarias inducidas por las proteínas ASFV y evaluar más a fondo el potencial vacunal de un cóctel de tres proteínas fusionadas con OprI.

Dado que las DC son centinelas profesionales del sistema inmunitario y vitales para la inducción de respuestas inmunitarias [42], se utilizaron BMDC murinas para evaluar la actividad estimuladora de las proteínas recombinantes. Las proteínas fusionadas con OprI pudieron activar las CD, como se demostró al secretar niveles más altos de TNF-α e IL-12p70. Los niveles de TNF-α inducidos por OPMT y OPET fueron similares a los de las proteínas de fusión OprI en un estudio anterior [31], mientras que el nivel de TNF-α inducido por OCET fue relativamente más bajo. La razón más probable de esto es la presencia de motivos inhibidores en CD2v o pEP153R. Esta deducción fue confirmada por un estudio reciente, donde se encontró que pEP153R disminuía la expresión de MHC clase I [43]. Se atribuyó la maduración y activación de las DC desencadenadas por proteínas fusionadas con OprI para activar la vía de señalización TLR2/4 [25]. Estos resultados sugieren que las proteínas fusionadas con OprI fueron capaces de activar las CD y pueden contribuir a la activación de las respuestas inmunitarias mediadas por células T.

Los datos de ELISA mostraron que la inmunización con la formulación O-Ags-T o la formulación Ags indujo niveles variados de respuestas de IgG en cerdos. Ambas formulaciones indujeron niveles igualmente altos de IgG frente a p30 y p54 en cerdos, lo que infirió que la fusión de OprI y TT-P2 frente a p30 y p54 tiene poco efecto sobre la inmunogenicidad de la proteína de fusión. Lo más probable es que esto se deba a que p30 y p54 son altamente inmunogénicos por naturaleza [44]. Por el contrario, la inclusión de OprI y TT-P2 mejoró en gran medida la inmunogenicidad de las proteínas de fusión de los epítopos p72 y △pE248R, y de △CD2v y △pEP153R (Fig. 4C-E). Este hallazgo sugiere que la estrategia de fusión OprI junto con TT-P2 es más capaz de mejorar la inmunogenicidad de las proteínas de fusión que consisten en proteínas ASFV menos inmunogénicas. Nuestros resultados demuestran que una combinación de proteínas de fusión OprI formuladas con ISA206 provoca respuestas inmunitarias humorales robustas, lo que profundiza nuestra comprensión de las funciones de OprI y TT-P2 cuando se fusionan con proteínas virales.

Dado que se ha demostrado que las respuestas inmunes celulares contribuyen en gran medida a la inmunidad protectora contra las infecciones intracelulares con ASFV [22, 45, 46, 47], determinamos la proliferación de linfocitos en PBMC después de la estimulación in vitro. Los cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T generaron un nivel significativamente mayor de proliferación de linfocitos que los cerdos inmunizados con la formulación Ags, lo que indica que la fusión de OprI y TT-P2 con proteínas/epítopos de ASFV mejoró notablemente las respuestas inmunitarias celulares contra ASFV. Además, en nuestro estudio también se determinaron las células T IFN-γ+ CD4+ e IFN-γ+ CD8+, que representan linfocitos T funcionales. De acuerdo con la proliferación de linfocitos, los porcentajes de células T IFN-γ+ CD4+ e IFN-γ+ CD8+ en cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T fueron significativamente más altos que los de los cerdos inmunizados con la formulación Ags o PBS. El IFN-γ secretado por los linfocitos T CD4+ y CD8+ contribuye a la polarización de las respuestas inmunitarias hacia el tipo Th1, y los linfocitos T CD8+ IFN-γ+ pueden ejercer actividad citolítica [48]. Estos resultados sugieren que la inmunización con el cóctel de proteínas fusionadas con OprI favorece la activación de las células T específicas del virus de la peste porcina africana y puede contribuir a la defensa contra la infección por el virus de la peste porcina africana.

Aunque se detectaron niveles más altos de IgG específicas de antígeno en los sueros de cerdos vacunados con la formulación O-Ags-T, se desconocía si los sueros inmunitarios eran capaces de neutralizar el virus. Por lo tanto, se realizaron ensayos de neutralización in vitro para analizar la capacidad de neutralización de ASFV de los sueros inmunes. Los sueros de cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T o la formulación Ags neutralizaron más del 80% del ASFV in vitro. En estudios anteriores, el suero de cerdos inmunizados con p30 recombinante expresada en baculovirus neutralizó alrededor del 90% del VPPA, cifra superior a la de nuestro estudio [49]. La razón más probable de esta discrepancia podría ser una mayor cantidad de inoculación de virus o un sistema de expresión de proteínas diferente empleado en nuestro estudio. Por el contrario, el porcentaje de neutralización de ASFV de los sueros de cerdos inmunizados con p54 o p72 fue relativamente menor en el mismo estudio. Más recientemente, los sueros de cerdos que recibieron una combinación de proteínas recombinantes de ASFV y genes de ASFV que expresan pcDNA exhibieron un porcentaje de neutralización de ASFV similar al nuestro a pesar de los diferentes ensayos utilizados en la prueba de neutralización [50]. Curiosamente, aunque los cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T produjeron niveles significativamente más altos de IgG contra p72, pE248R, CD2v y pEP153R que los de los cerdos inmunizados con la formulación Ags, el virus fue neutralizado igualmente bien por los sueros de los cerdos que recibieron cualquiera de los dos. a ellos. Esto probablemente se deba a que las IgG específicas de p30 y p54 juegan un papel dominante en la neutralización del ASFV, sin diferencias significativas entre los dos grupos (Fig. 4A y 4B). También encontramos que el ASFV no fue completamente neutralizado por los sueros de cerdos inmunizados con cualquiera de las formulaciones, como se muestra en la Fig. 7. Se informaron observaciones similares en estudios previos [51, 52], probablemente debido a la naturaleza compleja del ASFV.

Para investigar el efecto de la inmunidad celular en la infección por ASFV, se determinó la reproducción del virus en PBMC de cerdos inmunizados. De acuerdo con los porcentajes de linfocitos proliferativos y células T CD8+ IFN-γ+, se demostró que las PBMC de cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T o la formulación Ags inhibían significativamente la infección por ASFV in vitro en relación con las PBMC en los grupos de control. Se informaron observaciones similares en un estudio anterior, en el que las PBMC de macacos vacunados con el virus de la inmunodeficiencia simia (SIV) vivo atenuado fueron significativamente menos sensibles a la infección in vitro de SIV virulento que las PBMC de los controles ingenuos [53]. Los efectos inhibidores del virus de las PBMC se atribuyeron a los linfocitos T CD8+ específicos del virus [54]. De acuerdo con esto, las PBMC de cerdos inmunizados con la formulación O-Ags-T, que mostraron un porcentaje significativamente mayor de células T CD8+ IFN-γ+, inhibieron un porcentaje casi dos veces mayor de infección por ASFV in vitro que las PBMC de cerdos inmunizados con la formulación Ags. Estos datos sugieren que los linfocitos T activados por la inmunización con un cóctel de proteínas fusionadas con OprI son más capaces de inhibir la infección por ASFV in vitro y pueden dar lugar a respuestas inmunitarias celulares protectoras eficaces contra la exposición a ASFV.

El presente trabajo se realizó como una extensión de nuestro trabajo anterior que demuestra que OprI y TT-P2 en OPMT contribuyen a mejorar las respuestas inmunitarias específicas de p30 y p54 en ratones, y el anticuerpo inducido por OPMT mostró cierta actividad de neutralización contra ASFV in vitro [ 55]. Como resultado, se usaron OprI y TT-P2 para construir OPET y OCET para mejorar la inmunogenicidad de los epítopos p72, pE248R, CD2v y pEP153R, que demostraron inducir respuestas inmunitarias anti-VPPA [56]. Además, en el presente estudio se evaluaron las respuestas inmunitarias humorales y celulares inducidas por un cóctel de OPMT, OPET y OCET en cerdos, así como los efectos inhibidores del ASFV de los sueros inmunitarios y las PBMC. Los hallazgos de este estudio proporcionan la base para los experimentos de desafío con ASFV con la formulación O-Ags-T.

En resumen, nuestro trabajo demuestra que la inmunización con un cóctel de tres proteínas recombinantes de fusión OprI, cada una de las cuales contiene 2 proteínas/epítopos diferentes de ASFV fusionados con la lipoproteína bacteriana OprI y un epítopo universal de células T CD4+, formulado con adyuvante ISA206 inducido por potentes anticuerpos humorales específicos de ASFV. y respuestas inmunes celulares en cerdos. Lo que es más importante, el suero y las PBMC de los cerdos inmunizados inhibieron respectivamente el 82,8 % y el 92,6 % de la infección por ASFV in vitro, lo que probablemente se correlacione con una inmunidad protectora eficaz contra la exposición a ASFV. Los estudios adicionales deben apuntar a evaluar la eficacia protectora de la formulación de O-Ags-T como vacuna candidata contra el desafío letal de ASFV en cerdos, y será muy interesante explorar el papel de las diferentes proteínas de ASFV en las respuestas inmunitarias protectoras contra ASFV. En general, nuestro estudio proporciona información valiosa para el desarrollo de futuras vacunas de subunidades contra la peste porcina africana.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados en este estudio se obtienen y están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

peste porcina africana

virus de la peste porcina africana

Lipoproteína mayor de la membrana externa I

receptor tipo toll

Clúster de diferenciación

Células dendríticas derivadas de la médula ósea

Células mononucleares de sangre periférica

macrófagos alveolares porcinos

Suero bovino fetal

Instituto de Investigación Veterinaria de Lanzhou

Un epítopo P2 de células T CD4+ de toxoide tetánico universal

CD2v truncado pEP153R truncado

p72 epítopos-pE248R truncado

p30-p54 modificado

OprI-truncado CD2v-truncado pEP153R-TT

OprI-p72 epítopos-pE248R-TT truncado

OprI-p30-p54-TT modificado

Densidad óptica

Ácido etilendiaminotetraacético

Lisado de amebocitos de Limulus

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio

Temperatura ambiente

Anticuerpo monoclonal

Solución salina tampón de fosfato

PBS que contiene 0,05 % de Tween-20

Peroxidasa de rábano picante

lipopolisacárido

Factor de necrosis tumoral-α

Interleucina-12p70

interferón-γ

Un cóctel de OPMT, OPET y OCET

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

Días post vacunación

Inmunoglobulina G

5(6)-carboxifluoresceína diacetato succinimidil éster

Dosis hemadsorbentes al 50%

Alexa Flúor 647

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa

Isotiocianato de tetraetil rodamina

Multiplicidad de infección

Desviación Estándar

Sin importancia

Complejo mayor de histocompatibilidad

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Descargar referencias

Agradecemos a Aixiu Wang por su asistencia con la detección de endotoxinas, Lingxia Li y Ruoqing Mao por su asistencia con el análisis de citometría de flujo.

Este estudio fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional Clave de I+D de China (2021YFD1800034).

Laboratorio Estatal Clave para el Control y la Prevención de Enfermedades Animales, OIE/Laboratorio Nacional de Referencia para la Fiebre Aftosa de China, Instituto de Investigación Veterinaria de Lanzhou, Academia China de Ciencias Agrícolas, Lanzhou, Provincia de Gansu, China

Guanglei Zhang, Wei Liu, Sicheng Yang, Yunyun Ma, Guangqing Zhou, Xiaxia Liang, Chun Miao, Junhui Li, Yanhong Liu, Junjun Shao y Huiyun Chang

Instituto de Salud Animal, Academia de Ciencias Agrícolas de Guangdong, Guangzhou, China

Canción Shuai

Lanzhou Institute of Biological Products Co., Ltd. (LIBP), una empresa subsidiaria de China National Biotec Group Company Limited (CNBG), Lanzhou, 730046, China

Guanglei Zhang

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GZ, HC y JS concibieron los experimentos; GZ, WL, SY, YM realizaron los experimentos; GZ, XL, CM, JL e YL analizaron los datos; HC, JS y SS contribuyeron con reactivos/materiales/herramientas analíticas; GZ y HC escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Junjun Shao o Huiyun Chang.

Todos los experimentos relacionados con el virus de la peste porcina africana se realizaron en instalaciones de nivel 3 de bioseguridad en el Instituto de Investigación Veterinaria de Lanzhou (LVRI) en la Academia China de Ciencias Agrícolas (CAAS). Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las normas para la administración de asuntos relacionados con animales de experimentación aprobadas por la Comisión Estatal de Ciencia y Tecnología de la República Popular China y por el Comité de Bienestar y Seguridad Animal en el LVRI de la CAAS (No. LVRIAEC2018-008). Todos los animales utilizados en este estudio fueron sangrados humanitariamente durante los experimentos y sacrificados al final del estudio.

Todos los autores han accedido a publicar el manuscrito.

Los autores declararon no tener conflicto de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

: Figura S1. La estrategia de activación en la detección de células T productoras de IFN-γ en PBMC de cerdos inmunizados a los 42 dpv.

: Figura S2. El porcentaje de células T CD4+ productoras de IFN-γ (representadas por P8) en PBMC de cada cerdo inmunizado a los 42 dpv después de la estimulación in vitro con ASFV inactivado, medio o un cóctel de activación celular. El grupo 1 y el grupo 2 representan respectivamente cerdos inmunizados con formulación O-Ags-T o formulación Ags.

: Figura S3. El porcentaje de células T CD8+ productoras de IFN-γ (representadas por P5) en PBMC de cada cerdo inmunizado a los 42 dpv después de la estimulación in vitro con ASFV inactivado, medio o un cóctel de activación celular. El grupo 1 y el grupo 2 representan respectivamente cerdos inmunizados con formulación O-Ags-T o formulación Ags.

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Reimpresiones y permisos

Zhang, G., Liu, W., Yang, S. et al. Evaluación de las respuestas inmunes humoral y celular inducidas por un cóctel de antígenos recombinantes del virus de la peste porcina africana fusionados con OprI en cerdos domésticos. Virol J 20, 104 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02070-7

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Recibido: 20 de diciembre de 2022

Aceptado: 14 de mayo de 2023

Publicado: 26 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02070-7

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